[发明专利]一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法

说明书

本发明公开一种用于高温发酵生产γ‑聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG‑5，保藏编号为CCTCC NO：M 2017083，保藏日期为2017年3月6日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG‑5可在较高温度下利用糖质原料作为底物发酵生产γ‑聚谷氨酸，最高发酵温度可为55℃，发酵时间48~72h，产量最高可达15g/L以上。本发明提供的枯草芽孢杆菌可不依赖于外源性谷氨酸发酵生产γ‑聚谷氨酸，与以往的谷氨酸依赖型菌株相比，能够有效降低发酵生产成本，且具有发酵温度高、营养要求简单和培养方法简便易行等优点，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。

技术领域

本发明属于微生物工程领域，特别涉及到一株用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键结合而成的微生物源阴离子型胞外高分子化合物。γ-聚谷氨酸分子量可达1,000kDa以上，其分子主链上大量游离亲水性羧基使其具有水溶性聚羧酸性质，并可作为活性位点进行广泛的化学修饰，因此赋予其强吸水保湿、絮凝性和优良的可塑性；另一方面，γ-聚谷氨酸分子主链中的酰胺键易被酶解，降解产物可被生物体吸收，因此赋予其优良的生物降解性和生物相容性，对人体和环境无毒害。这些优良生化特性使得γ-聚谷氨酸及其衍生物可广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和环境保护等领域。

γ-聚谷氨酸最早于1937年在炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）荚膜成分中发现，该物质能伴随着菌体细胞的裂解而释放到培养液中。1942年，γ-聚谷氨酸被发现可作为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产物自由分泌到培养液中，随后多株芽孢杆菌属菌株被报道可合成胞外γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸生产菌株依据发酵培养基中是否需要添加谷氨酸，分为谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株两类。其中，研究比较深入地谷氨酸依赖型菌株有：B. subtilis F-2-01、B. subtilis IFO3335、B. subtilis NX-2、B.licheniformis ATCC 9945A、B. licheniformis WX-02，在此类菌株中谷氨酸既是γ-聚谷氨酸合成诱导剂，又是γ-聚谷氨酸合成底物。谷氨酸非依赖型菌株有：B. subtilis TAM-4、B. licheniformis A35、B. amyloliquefaciens LL3，在此类菌株中底物谷氨酸主要是利用葡萄糖或蔗糖等糖质原料经糖酵解途径和三羧酸循环转化而来。

目前，γ-聚谷氨酸发酵生产研究主要使用谷氨酸依赖型菌株，并采用合成培养基，其中碳氮源和L-谷氨酸是必需组分，pH值一般维持在6.5~7.5，温度30℃~40℃，产物产量与适宜的碳氮比、谷氨酸添加量以及生物量密切相关，各种无机盐比例对γ-聚谷氨酸高效生产也至关重要。相对于谷氨酸依赖型菌株而言，谷氨酸非依赖型菌株的报道和研究相对较少，主要是由于其γ-聚谷氨酸产量相对较低。但是，从发酵原料成本的角度考虑，谷氨酸非依赖型菌株可以利用廉价的糖质原料作为底物生产γ-聚谷氨酸，而不需要使用价格相对较高的谷氨酸或谷氨酸盐作为底物。因此，如果能够选育获得一株γ-聚谷氨酸产量较高的谷氨酸非依赖型菌株，将从节约原料成本角度为γ-聚谷氨酸工业化大规模生产提供另外一种选择。

此外，γ-聚谷氨酸产生菌的发酵温度一般在30℃~40℃，然而在发酵过程中，由于微生物生长和代谢会产生大量的热量，尤其是在夏天或者南方地区，需要提供大量的冷却水对发酵罐进行热交换从而保持发酵过程所需要的特定温度。因此，如果能够从菌种角度出发，选育获得一株能够在较高温度下发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株，将从节约发酵工艺成本的层面为γ-聚谷氨酸工业化大规模生产提供另外一种选择。

发明内容