[发明专利]一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法

权利要求书

1.一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌，其特征在于：所述菌命名为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG-5，保藏编号为CCTCC NO：M 2017083，保藏日期为2017年3月6日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）菌种活化：将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG-5接于固体斜面培养基上，45~50℃培养12-24h；

（2）种子液制备：将步骤（1）所述斜面培养基上1~3cm²的菌苔接入装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160~200rpm，45~50℃培养12~24h至菌株对数生长中期；

（3）液体摇瓶发酵：将步骤（2）所得种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量1~10%（v/v），三角瓶装液量20~80mL/250mL，摇床转速160~250rpm，40~55℃培养48~72h，得到成熟发酵液；

（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集步骤（3）所得成熟的发酵液，加入2~5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为10~50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30~50%，加入2~4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。

3.根据权利要求2所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（1）所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10~15g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨3~6g/L，NaCl 3~6g/L，琼脂15~20g/L，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制。

4.根据权利要求2所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（2）所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10~20g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨5~10g/L，NaCl 5~10g/L，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制。

5.根据权利要求2所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）所述液体发酵培养基浓度组成为：糖质原料10~50g/L，氮源5~30g/L，KNO₃2~10g/L，NaCl 2~10g/L，K₂HPO₄ 0.5~5g/L，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制。

6.根据权利要求5所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基中糖质原料为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。

7.根据权利要求5所述非谷氨酸依赖型产生菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基中氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄和NH₄NO₃中的任意一种或几种混合物。