[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法

说明书

本发明提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法。具体而言，本发明选用阳离子层析柱纯化含有重组人粒细胞集落刺激因子(rhG‑CSF)的复性液，再进行适当的缓冲液置换制备获得高纯度的rhG‑CSF原液，其中所述阳离子层析柱中填料为混合模式的阳离子型。本发明纯化工艺简化了工艺路线，节省了生产时间，并且蛋白回收率高，所获得的蛋白原液纯度高，加入适当的药用辅料即可制备成药物制剂，十分适合大规模工业化放大生产。同时本发明还提供一种制备聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的方法。

技术领域

本发明涉及的是生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的纯化方法，本发明操作简单、时间短，适合于工业化放大生产。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)能够特异地作用于粒系祖细胞，促进其增殖并分化为成熟的中性粒细胞，是调节骨髓中粒系造血细胞的主要细胞因子之一。其对于由癌症化疗、急性白血病化疗、骨髓增生异常综合征及再生障碍性贫血等疾病引起的中性粒细胞缺乏症和骨髓移植时的中性粒细胞增加等均有明显的疗效。

hG-CSF的来源是非常有限的，因此，大规模工业化生产均采用基因工程的方法获得。目前国内外制药企业大多采用应用广泛的大肠杆菌系统来表达rhG-CSF。由于大肠杆菌细胞内的还原环境不利于二硫键的形成，rhG-CSF折叠错误，容易聚集，基本以无生物活性的包涵体形式存在于细胞中。包涵体经过变性和复性才能获得有活性的rhG-CSF。目前，专利中对rhG-CSF的复性方法报道众多，研究极为清楚。

无论采用哪种复性方法，不可否认，复性后样品中仍含有大量的宿主细胞蛋白以及产品相关杂质，因此，复性后的纯化工艺是决定产品质量合格与否的重要步骤，而一个成功的纯化工艺要同时兼顾产品纯度、收率、工艺周期、生产成本、可操作性等多方面因素。

US5849883、CN1167150、CN1206716、CN1814779等均报道采用多步层析方法搭配，用于纯化大肠杆菌重组表达的rhG-CSF。如US5849883、CN1206716、CN1814779均同时利用弱阳离子(如，CM Sepharose)和弱阴离子(如，DEAE Sepharose)交换层析。在生产工艺中，层析步骤多会大大增加工艺验证、清洗验证的工作量，同时增加处理样品的时间，同时，多步骤处理工艺还会影响蛋白的回收率。因此，开发一步层析方法用于纯化rhG-CSF具有很好的应用前景。

而rhG-CSF一步层析纯化方法所用填料多涉及强阳离子交换层析(如，SP填料)和弱阳离子交换层析(如，CM填料)。

CN1718739A报道了采用SP Sepharose High Performance(SP HP)直接对rhG-CSF复性液纯化的方法，在pH5.4的条件下，利用NaCl浓度洗脱目的蛋白。但是包涵体复性液中除了目的蛋白外，还含有一定量的宿主蛋白、脂类和脱氧核糖核酸(DNA)。SP HP填料的粒径很小，为30μm，一般用于精制纯化，不适合用于含有较多杂质、情况复杂的复性液。而且粒径小使得生产上层析柱的压力很大，流速变慢，增加工艺操作时间。

CN1663962A报道的对复性后的rhG-CSF采用SP Sepharose Fast Flow(SP FF)纯化的方法：在pH4.0(10mmol/L乙酸-乙酸钠)的条件下上样，pH7.0(100mmol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠)洗脱目的蛋白。但是SP FF对样品离子强度有要求，一般不超过5mS/cm。其中，样品复性液中含有较高浓度的尿素，使用中空纤维进行浓缩、稀释、浓缩等一系列操作，以获得符合SP FF上样要求的样品。因此，该方法操作繁琐，增加工艺放大的难度。