[发明专利]一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用

说明书

一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。目前在鱼中发现了3种XCR1样趋化因子受体，即XCR1、XCR1L和CCR12，其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现，但关于其功能研究甚少，截止目前，尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道，尚未有人制备过斜带石斑鱼的CCR12多克隆抗体，关于CCR12多克隆抗体的应用更无任何报道。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况，鉴定CCR12阳性细胞类型，本研究首次通过原核系统表达纯化了CCR12的N‑端区和3个胞外区重组蛋白，并最终首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体，该抗体能特异性识别石斑鱼CCR12蛋白，且标记血液中的细胞，为我们今后标记CCR12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

趋化因子是一类分子量非常小的细胞因子，他们具有相似的单体结构(Baggiolini，1998；Jin et al.，2005)。根据其结构和4个保守半胱氨酸的排列顺序，可将趋化因子分为：CXC型、CC型、XC型、CX3C型和CX型等5类(Murphy，et al.，2000；Nomiyama etal.，2008)。趋化因子行使功能时，需要与其相应的受体结合。XCL1是一种XC型趋化因子，在稳态、病原感染或炎症反应时，由胸腺髓样上皮细胞、或激活的T细胞、NK细胞、以及NKT细胞产生(Lei et al.，2012)。XCR1是XCL1唯一的受体，由CD8α⁺和CD11b^-CD103⁺DC细胞分泌(Alexandre et al.，2013)。XCL1-XCR1轴在维持内稳态、调节性T细胞产生、以及DC细胞介导的细胞毒性反应中都起到重要作用(Lei et al.，2012)。此外，XCL1-XCR1轴还参与感染和自生免疫疾病。

目前，鼠基因组中只鉴定到XCL1这一种趋化因子XC亚家族成员，但在人基因组中鉴定到XCL1和XCL2两种(DeVries et al.，2006；Fox et al.，2015)。XCL1是哺乳动物和鸟中普遍存在的趋化因子，但XCL2仅仅在一些物种中存在(Nomiyama et al.，2011)。在鱼中，目前尚未鉴定到XCL1或XCL2同源蛋白，但发现了3种XCR1样趋化因子受体，即XCR1、XCR1L和CCR12(Grimholt et al.，2015；Nomiyama et al.，2011)。其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现，但关于其功能研究甚少，且抗XCR1L或CCR12抗体的缺乏也限制了对其阳性细胞的分离及功能的研究。截止目前，尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道，更无关于CCR12多克隆抗体的研究。

我们研究发现：刺激隐核虫感染后，石斑鱼CCR12在皮肤、鳃和脾脏中的表达量显著增加，推测CCR12阳性细胞参与石斑鱼抗寄生虫感染过程。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况，鉴定CCR12阳性细胞类型，本研究首次构建了石斑鱼CCR12胞外区表达载体，首次通过原核系统表达纯化了CCR12的N-端区和3个胞外区重组蛋白，并最终首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体，该抗体能特异性识别石斑鱼CCR12蛋白，且标记血液中的细胞，为我们今后标记CCR12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。

发明内容

到目前为止，尚未有人制备过斜带石斑鱼的CCR12多克隆抗体，关于CCR12多克隆抗体的应用更无任何报道，而本发明通过基因工程方法，首次成功表达纯化了斜带石斑鱼CCR12，并首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体，同时对其初步应用也进行了一定研究。

本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用，具体步骤如下：

(一)石斑鱼CCR12基因克隆及序列分析：

1、石斑鱼脾脏总RNA的提取