[发明专利]一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用

权利要求书

1.一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤如下：

(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化：

I、CCR12重组表达载体的构建

(1)目的片段扩增；

a.通过SMART软件分析，斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白，由一个N-端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C-端区构成；选择斜带石斑鱼CCR12的N-端区和3个胞外区进行扩增；

b.以CCR12N端正向引物/反向引物、CCR12胞外区1正向引物/反向引物、CCR12胞外区2正向引物/反向引物和CCR12胞外区3正向引物/反向引物为引物，以石斑鱼cDNA为模板，用高保真酶PrimeSTAR^TMMix分别扩增CCR12的N-端区和3个胞外区；

c.再以CCR12N端正向引物/胞外区1反向引物为引物，步骤b扩增的CCR12N-端区和第1个胞外区为模板，通过重组PCR连接N-端区和第1个胞外区；同时，以CCR12胞外区2正向引物/胞外区3反向引物为引物，以步骤b扩增的CCR12的第2和第3个胞外区为模板，通过重组PCR连接第2和第3个胞外区；

d.最后，以CCR12N端正向引物/胞外区3反向引物为引物，以步骤c连接成功的两个融合片段为模板，通过重组PCR将CCR12的N-端区和3个胞外区连接到一起，胶回收目的片段；

其中，引物CCR12N端正向引物的序列为CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT，引物CCR12N端反向引物的序列为AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG，扩增片段为41bp；引物CCR12胞外区1正向引物的序列为GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG，引物CCR12胞外区1反向引物的序列为AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC，扩增片段为87bp；引物CCR12胞外区2正向引物的序列为GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA，引物CCR12胞外区2反向引物的序列为GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA，扩增片段为135bp；引物CCR12胞外区3正向引物的序列为GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC，引物CCR12胞外区3反向引物的序列为CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT，扩增片段为96bp；引物序列中下划线部分表示酶切位点；

(2)表达载体的提取；(3)双酶切目的片段和表达载体；(4)重组表达载体构建：通过菌落PCR法鉴定阳性克隆，并进行测序；

II、CCR12重组蛋白表达条件的优化

(1)CCR12重组蛋白的诱导表达；

(2)CCR12重组蛋白表达条件的优化；

a.IPTG浓度的优化；b.诱导时间的优化；

III、CCR12重组蛋白的纯化；

(二)斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备：

I、CCR12多克隆抗体制备：

(1)将两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周；

(2)取约2mg CCR12重组蛋白，加入PBS至2ml，加入2ml弗氏完全佐剂，反复推拉共轭注射器使CCR12重组蛋白乳化；

(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的CCR12重组蛋白，先用75％酒精棉对新西兰雄兔多个注射位点消毒，再进行皮下注射，注射剂量为1ml/只；

(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫一半CCR12重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后，对新西兰雄兔进行皮下注射，共加强免疫3次，每次间隔时间均为2周；

(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清，56℃处理30min以灭活补体，用proteinA柱子进行纯化，分装后-20℃保存；

II、ELISA测定多抗效价；

III、Western blotting检测多抗的特异性：

(1)提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白；

(2)多抗的特异性检测：

a.抗原蛋白SDS-PAGE电泳后，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；

b.将PVDF膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；

c.按照黑板即负极、泡沫垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、泡沫垫、白板即正极的顺序固定凝胶和PVDF膜，注意排除气泡；

d.将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100V转膜23min；

e.转膜结束后，取下PVDF膜，加入10％脱脂奶粉室温封闭1h；

f.加入上述步骤(二)I制备的CCR12多克隆抗体，4℃孵育过夜；

g.弃去CCR12多克隆抗体，用PBST洗涤3次，每次5min；

h.加入用10％脱脂奶粉稀释的二抗室温孵育1h；

i.弃去二抗，用PBST洗涤3次；

j.用化学发光法进行显示拍照。