[发明专利]特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh6及其应用

说明书

本发明公开了特异结合膜联蛋白A2（Annexin A2,ANXA2）的核酸适体wh6及其应用，wh6序列如SEQ ID NO.3所示，该核酸适体能够与ANXA2特异结合，因此可以用于ANXA2的纯化和浓缩，可作为ANXA2定量或定性检测试剂。进一步研究表明wh6能阻断ANXA2的作用，抑制多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）细胞的生长和粘附。wh6还可以与临床治疗MM药物结合通过作用ANXA2蛋白进行靶向递送和体内成像，应用前景广泛。

技术领域

本发明属于适体领域，具体涉及特异结合ANXA2的核酸适体，还涉及该适体的应用。

背景技术

膜联蛋白A2（Annexin A2, ANXA2）是由339个氨基酸组成的分子量为36 kDa的蛋白质, 是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，在细胞中可以单体(p36)、异源二聚体(p36/p11)和异源四聚体(p362/p112)三种形式存在。它在结构上高度保守并且在几乎所有真核生物中表达，主要分布在细胞膜、细胞浆中，一小部分存在于细胞核中。ANXA2 主要表达于内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经细胞和一些肿瘤细胞；在脑癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌以及血液肿瘤中表达上调。ANXA2在肿瘤中的异常表达与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后密切相关。ANXA2在高侵袭、高转移的恶性肿瘤中的异常表达，提示ANXA2有望成为判断肿瘤浸润和转移能力及肿瘤病人预后的标志物，可作为肿瘤治疗潜在的靶分子，该核酸适体可用于肿瘤早期检测及治疗。

目前，ANXA2的检测方法主要有免疫组化法，酶联免疫法等免疫学检测法。依赖抗体的免疫学检测法操作简单，灵敏度高，无需大型昂贵仪器设备，适用于大量样品的检测，但是这种方法检测的假阳性率比较高，定量也不够准确。并且抗体试剂稳定性差，储存条件较DNA核酸适体严格。核酸适体能与各种有机物或无机物靶标分子高特异性、高亲和力结合，同时具有分子量小，免疫原性低，稳定性好，制备和标记方便等优点。核酸适体作为抗体分子的替代分子，在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。但迄今尚无针对ANXA2的DNA核酸适体报道或公开，因此有必要开发一种可特异结合ANXA2的核酸适体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供特异结合并作用ANXA2的核酸适体。

本发明人通过采用消减筛选的策略，利用GST-ANXA2融合蛋白作为筛选靶标，获得与融合蛋白结合的DNA序列，进一步通过将GST蛋白作为负性筛选，将与GST蛋白结合的DNA序列去掉，获得与ANXA2蛋白特异结合的核酸适体，通过筛选获得了一条特异结合ANXA2的核酸适体（命名为wh6）。所述核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供所述特异结合ANXA2的核酸适体在制备检测ANXA2试剂中的应用。通过将ANXA2蛋白与酶标板结合，然后利用生物素标记的wh6核酸适体孵育结合；PBS洗板后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，加入过氧化物酶的底物显色，通过酶标仪检测并计算ANXA2的浓度。

本发明提供所述特异结合ANXA2的核酸适体在纯化和浓缩ANXA2中的应用。ANXA2蛋白与生物素标记的wh6核酸适体结合，然后加入链霉亲和素磁珠孵育，通过磁珠可将ANXA2纯化和浓缩。

本发明提供特异结合ANXA2的核酸适体在制备靶向ANXA2药物中的应用。细胞膜表面的ANXA2蛋白能与多种蛋白结合发挥其生理作用，wh6能与ANXA2蛋白结合，可能阻断ANXA2蛋白与其它蛋白的相互作用，其功能表现为wh6阻断ANXA2蛋白促进MM.1S和RMPI-8226细胞的生长，wh6能抑制MM1.S和RPMI-8226细胞对ANXA2蛋白的粘附作用。

本发明的有益效果在于：