[发明专利]热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程领域。本发明突变体主要是将谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第5‑7位的谷氨酰胺Q、缬氨酸V和苏氨酸T进行饱和突变，筛选获得高稳定突变体Q5E/V6S/T7V、Q5Y/V6R/T7K、Q5N/V6Y/T7V。本发明获得的谷氨酸脱羧酶突变体的半失活温度为45‑50.5℃，比野生型提高了4.9‑10.2℃；在45℃下的半衰期为76‑129min，比野生型(24min)提高了3.2‑4.3倍。以重组大肠杆菌合成的谷氨酸脱羧酶突变体全细胞转化谷氨酸12h，可得到260‑350g/L的γ‑氨基丁酸(GABA)，摩尔转化率为76.6％‑97.8％。本发明所得到的谷氨酸脱羧酶突变体热稳定性明显提高，更利于γ‑氨基丁酸的生产需求，为高效合成γ‑氨基丁酸奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶(GAD)突变体及其应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有降血压、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等功能,在医药、食品保健、化工、农业等方面具有广泛的应用。目前国内外主要采用化学合成法、微生物发酵法和生物转化酶法制备γ-氨基丁酸。化学法合成GABA的过程中，需要用到强酸或强碱等腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，原料毒性大，价格昂贵且存在较多安全隐患等问题；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低，但后处理过程复杂且生产周期长；生物转化酶法合成GABA可提高底物转化率和产品纯度,具有节约后处理工序、缩短生产周期及降低环境污染等优点，是未来GABA制备工艺开发的主要方向。

生物转化酶法合成GABA主要利用了能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳的谷氨酸脱羧酶(GAD，EC4.1.1.15)。该酶广泛存在于原核和真核生物细胞中，是GABA生物合成的限速酶，相关研究报道很多。为解决天然GAD不足的问题，人们克隆了大肠杆菌、乳酸菌、嗜热链球菌等的GAD基因，并在大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌中进行了表达，并有相关专利报道(申请号：201010567447.9，201110289796.3,201210431917.8,201510229161.2，201510198433.7，201510819438.7)。为解决多数GAD最适pH低(3.8-4.5)，pH高于6.0时易失活问题，人们利用基因改造获得了近中性pH稳定性提高的突变体(如大肠杆菌或乳酸菌GAD的C末端455-456位缺失的突变体、植物乳杆菌GAD 89位谷氨酸E突变为精氨酸R或丙氨酸A的突变体(申请号201510819438.7)，并通过用酸调节并维持反应体系pH、用L-谷氨酸取代谷氨酸钠为底物、在反应体系中添加阳离子交换树脂等优化酶转化反应条件与方式等。

良好的热稳定性是理想的生物催化剂应具备的条件之一。细菌中的GAD酶最适反应温度一般在30-50℃之间，在50℃以上极易失活。短乳杆菌GAD酶在55℃下半衰期为30.9min，大肠杆菌GAD酶在50℃半衰期为24min，非常不利于GAD在GABA生物制备中的应用。在保证GAD酶活性基础上，提高GAD的热稳定性是工业生产GABA中需要迫切解决的问题。申请号201110297056.7的专利公开了热稳定性提高的短乳杆菌GAD 311位甘氨酸G突变为脯氨酸P的突变体G311P。申请号201110297904.1的专利公开了热稳定性提高的短乳杆菌GAD56位甘氨酸G突变为脯氨酸P的突变体G56P。申请号201510952734.4的专利根据嗜热古细菌GAD氨基酸序列比对信息，经定点突变在短乳杆菌对应位点引入脯氨酸P，筛选到55℃下半衰期比野生型延长了14.5min的突变体G364P。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。

发明内容

本发明的目的就是提供热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体，并提供其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：