[发明专利]一种引物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及医学分子诊断及生物技术，具体涉及一种引物组及其应用，尤其涉及一种用于肥厚型心肌病相关致病基因热点突变的检测的引物组合物及其应用。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)为一种最常见的遗传性心脏疾病，主要表现为左心室或双心室不对称性肥厚，较少患者表现出左室流出道梗阻。主要病理特征为心肌细胞弥漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纤维紊乱等。HCM临床表现从无征兆到呼吸困难、晕厥、胸痛甚至发生心源性猝死和致命性的心律失常。

HCM是第一个从遗传角度阐明病因的遗传性心脏疾病。1990年在一个加拿大家族性肥厚型心肌病患者中发现第一个致病基因MYH7，其遵循的是常染色体显性遗传模式。HCM的全球发病率和年死亡率分别约为1/500和1％。相关证据表明，Zou等人随机抽查中国9个省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并对其进行超声心动图检测，结果表明中国人群患HCM的概率大约为0.8/500。实际上，超声心动图对肥厚型心肌病的检测为一种患病后的诊断方式，还存在更多潜在的HCM患者，依此推断，中国人群中至少存在200万HCM患者。该病也是是青少年和年轻运动员猝死的最主要原因之一，Morn等人对1986-2006年猝死的1886名美国年轻运动员进行统计分析发现，死亡的主要原因为心血管疾病1056名，占约56％，其中HCM的患者就占据了36％。

众多研究表明，HCM主要由肌节基因突变所致，故HCM又称为肌小节疾病。HCM主要遵循常染色体显性遗传模式，大约有50％的HCM患者为家族性遗传，称为家族性肥厚型心肌病(FHCM)。对HCM患者进行基因检测和家族筛 查能够为临床诊断提供重要的指导作用，主要体现为：1)产前诊断，指导优生优育；2)辅助明确诊断，进行临床干预；3)家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理。

目前，遗传疾病基因突变的检测方法较多，如：限制性片段长度多太性、单链构象多态性、高分辨率溶解曲线分析、荧光定量PCR的检测方法、PCR扩增直接测序和高通量测序。上方法各有优缺点，毛细管电泳技术是基因突变检测的金标准，但因其对设备的要求高、价格昂贵等缺点，很难从实验室普及到临床，荧光定量PCR具有快速、简便、经济和准确等特点。

CN 102965428A公开了一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。该试剂盒采用探针捕获测序，与其他传统的DNA芯片杂交和毛细管电泳测序技术一样，不仅费时费力，而且价格昂贵，根本不能满足对HCM的基因检测。

值得一提的是TaqMan-MGB荧光定量PCR的检测方法，该方法与传统的TaqMan不同的是在探针的3’端连接了非荧光的猝灭基团MGB(minor groove binder，MGB)，当探针序列与模板结合时，MGB能高度结合于DNA双链的小沟，增加了寡核苷酸探针和单链模板结合的稳定性，由此通过缩短探针序列长度，增加探针序列的特异性，实现了能区分一个碱基的差别。当具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶对碱基进行延伸时，可把发光基团解离下来，解除了非荧光的猝灭基团对发光基团的抑制，实现了荧光信号的积累与PCR产物的同步进行，从而能较好的区分野生型、纯合突变和杂合突变样本。TaqMan-MGB对单核苷酸多态性检测方面有较多的应用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐药突变检测和肿瘤细胞P⁵³基因突变等。

CN 104388595 A公开了一种猪圆环病毒2型实时荧光定量 PCRMGB-TaqMan探针检测方法，该方法利用荧光定量PCR技术，采用MGB探针，建立了猪圆环病毒2型(PCV2)检测方法。但目前MGB探针还未用于HCM的检测。

因此，为肥厚型心肌病建立一种简便、快速、经济和准确的突变筛查方法，为肥厚型心肌病的预防、辅助临床诊断和预后评估提供技术平台显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种引物组及其应用，本发明通过所述引物组可以构建阳性野生型和纯合突变型五个热点突变位点(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G和PRKAG2-c.298G>A)的载体，应用ABI7500实时荧光PCR仪，对每个阳性样品同时进行联合检测，建立一种简便、快速、准确和经济的肥厚型心肌病基因突变检测方法，为肥厚型心肌病的临床早期诊断和预防提供了新的技术平台。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：