[发明专利]一种引物组合物及其应用

权利要求书

1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括检测MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G或PRKAG2-c.298G>A这五个热点突变位点的五组实时荧光PCR引物和Taqman-MGB探针序列中的至少一组。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述检测MYH7-c.1987C>T热点突变位点的实时荧光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述Taqman-MGB探针的核酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；

优选地，所述检测TNNI3-c.370G>C热点突变位点的实时荧光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述Taqman-MGB探针的核酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

优选地，所述检测MYH7-c2155C>T热点突变位点的实时荧光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，所述Taqman-MGB探针的核酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；

优选地，所述检测TNNI3-c.433C>G热点突变位点的实时荧光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述Taqman-MGB探针的核酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；

优选地，所述检测PRKAG2-c.298G>A热点突变位点的实时荧光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.17-18所示，所述Taqman-MGB探针的核酸序列如SEQ ID NO.19-20所示。

3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述Taqman-MGB探针的核酸序列5’端标记有发光的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团；

优选地，所述发光的报告荧光基团为FAM、HEX或Cy5中的任意一种；

优选地，所述不发光的淬灭基团为MGB小分子化合物。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的引物组合物中的五组实时荧光PCR引物和Taqman-MGB探针序列中的至少一组。

5.如权利要求1-3中任一项所述的引物组合物或如权利要求4所述的试剂盒用于肥厚型心肌病相关致病基因热点突变的检测。

6.一种肥厚型心肌病相关致病基因热点突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取基因组；

(2)以步骤(1)的基因组为模板，进行PCR扩增，构建野生型、纯合突变型及杂合突变型阳性质控品；

(3)利用ABI7500实时荧光PCR仪将步骤(2)得到的阳性质控品采用如权利要求1-3中任一项所述的引物组合物进行实时荧光PCR检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(2)所述的PCR扩增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示；

优选地，步骤(2)所述的PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；72℃延伸5分钟；

优选地，构建野生型、纯合突变型及杂合突变型阳性质控品的具体步骤如下：将PCR扩增产物进行纯化，将纯化后的片段克隆到PMD-18T载体上，转化到大肠杆菌JM109，挑选单克隆，测序验证野生型及纯合突变型阳性质粒，将野生型和纯合突变型阳性质粒按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型阳性质控品。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测MYH7-c.1987C>T热点突变位点的反应体系为：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII缓冲液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.3 0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.4 1μL，基因组0.5μL和ddH₂O为2.8μL；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR条件中检测MYH7-c.1987C>T热点突变位点的PCR反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测TNNI3-c.370G>C热点突变位点的反应体系为：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII缓冲液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.7 0.1μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.8 1.2μL，基因组0.5μL和ddH₂O为2.7μL；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测TNNI3-c.370G>C热点突变位点的PCR反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测MYH7-c2155C>T热点突变位点的反应体系为：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII缓冲液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.11 0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.12 1.2μL，基因组0.5μL和ddH₂O为2.6μL；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测MYH7-c2155C>T热点突变位点的PCR反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测TNNI3-c.433C>G热点突变位点的反应体系为：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII缓冲液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.15 0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.16 0.8μL，基因组0.5μL和ddH₂O为3μL；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测TNNI3-c.433C>G热点突变位点的PCR反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测PRKAG2-c.298G>A热点突变位点的反应体系为：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII缓冲液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.19 0.1μL，Taqman-MGB探针SEQ ID NO.20 0.5μL，基因组0.5μL和ddH₂O为3.8μL；

优选地，步骤(3)所述的实时荧光PCR的条件中检测PRKAG2-c.298G>A热点突变位点的PCR反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min。