[发明专利]基因组大片段直接克隆和DNA多分子组装新技术

说明书

一种基因组大片段直接克隆和DNA多分子组装新技术。本发明提供了同源重组的方法，所述方法包括使用第一核酸外切酶处理两个或两个以上目标核酸分子，然后使处理后的目标核酸分子在第二核酸外切酶和退火蛋白的存在下进行同源重组，其中发生同源重组的目标核酸分子之间共享至少一段序列同源区域。本发明还提供了用于本发明的方法的试剂盒。

技术领域

本发明涉及核酸克隆和组装方法，更具体涉及脱氧核糖核酸（DNA）克隆和组装的新方法。

发明背景

DNA克隆是分子生物学和生物技术的核心内容，是进行基因功能研究的关键技术。随着DNA测序技术的不断进步和测序成本的不断降低，全基因组测序变得越来越容易。人们发现基因组中蕴藏着丰富的尚未开发的资源。短的DNA片段可以很容易通过PCR或者化学合成获得，但是克隆大于10 kb的DNA片段传统方法则要依赖于DNA文库的构建和筛选。传统的文库构建和筛选的方法不但操作复杂、耗时、费力，而且目的DNA片段经常分散的位于几个不同的克隆上，在进行基因功能研究时往往需要对其进行亚克隆，删除多余序列或者需要将其缝合成一个完整地生物合成途径，因此传统的文库构建和筛选的方法已经不能满足时代发展的需要，研究者们迫切需要简单、高效和快捷的基因组DNA 克隆和修饰技术。随着合成生物学技术的进步，大于10 kb的DNA大片段还可以通过Gibson体外组装¹或者DNAassembler体内组装²等方式由小片段组装而成。但是上述DNA组装需要PCR或者化学合成来制备小片段，容易引入随机突变并为后期基因功能研究带来不便。同时，上述方式对于要组装的DNA片段的量要求较高，需要采用纯度和浓度相对较高的目标DNA片段，不能用于直接从酶解的基因组DNA片段混合物中组装目的DNA片段。

直接从基因组DNA中将特定的DNA区域克隆到载体中，在本文中称为“直接克隆”。RecET直接克隆技术的原理是：Rac噬菌体重组蛋白——全长的RecE和RecT能够在大肠杆菌细胞内高效地介导线性DNA分子之间发生同源重组——线线重组。其中RecE是5’-3’核酸外切酶，RecT是单链DNA退火蛋白，RecE和RecT之间的蛋白-蛋白相互作用是线线重组所必须的，RecET联合作用的线线重组效率是单独作用的1000倍。RecET直接克隆技术能将大于10kb的基因组DNA片段直接捕获到表达载体上，而且还能实现2~5个DNA片段的组装。在基因组上一般都能找到合适的限制性酶切位点将目的DNA片段释放出来，然后将限制性酶切的基因组DNA和线性载体通过电转化导入表达了RecET重组酶的大肠杆菌细胞内，在细胞内目的DNA片段和线性载体通过两端的同源臂发生同源重组并形成环状质粒，最后通过抗生素筛选和限制性酶切分析可以获得含有重组DNA分子的菌落。在线性载体和基因组DNA都制备好了的情况下，完成目的DNA片段的直接克隆只需要3天的时间。目前该技术已被广泛应用于细菌天然产物生物合成途径的克隆和异源表达研究。比如来源于发光杆菌发光光杆状菌的10个10-52 kb的聚酮合酶（PKS）/ 非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因簇³，来源于类芽孢杆菌Paenibacillus larvae中的12 kb sevadicin基因簇⁴，来源于丁香假单胞菌Pseudomonas syringae中的19 kb syringolin基因簇⁵，来源于伯克氏菌Burkholderia DSM7029中的25kb glidobactin基因簇⁶，以及来源于大肠杆菌E. coli Nissle 1917中的50 kbcolibactin基因簇⁷。