[发明专利]一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，属于生物工程领域。

背景技术

藻类是一个多样性较高的生物类群，在整个群体中占据着非常重要的位置，而且在整个生命类群中属于比较古老的类群。随着分子生物学的发展，藻类的基因组学的研究将有助于我们更加清晰的了解藻类的独特之处，获得更加丰富的基因信息，从而来揭示其神秘的机制。过去几年中，随着高通量技术的成熟及成本的下降，藻类基因组（核基因组和细胞器基因组）已经取得了较大的突破，这些研究成果不仅有助于帮助我们了解藻类一些特殊的性状和分子机制，而且有助于加强我们对藻类乃至光合生物的起源和进化的认识；此外，现在很多学者致力于利用分子生物学的技术来进行优良藻种的选育，从基因组信息来探索一条适合藻类分子育种的新途径，进而提高优良藻种的选育速度。因此，建立藻类基因组对揭示其生命原理及促进藻类产业发展具有深远意义。

目前由于新一代高通量测序技术的迅猛发展，很多非模式生物的全基因组测序工作开始进行或者已经完成，摆脱了以往非模式生物遗传背景匮乏的现象。作为海洋低等物种的藻类，尽管已有一些藻类的基因组工作完成，但相对于高等植物而言，对其基因组的研究数量还是相当匮乏的；这是由于藻类DNA中多糖、多酚、高拷贝质体和线粒体DNA的存在，制约了藻类核基因组测序工作的进展。所以首先获得高质量和高分子量的藻类核DNA是进行相关工作的第一步，也是所有工作的前提条件。

对于藻类物种来说，由于其在生长过程中会产生多酚、多糖等次级代谢产物，增加了DNA提取的难度。随着对藻类的进一步研究，发现在藻类的总DNA中存在着高拷贝的质体和线粒体DNA，这就意味着在实验过程中只可以得到核DNA占很少比例的DNA，如果用这种DNA来进行高通量测序，不仅会增加测序的成本，而且会降低我们对于藻类基因组信息了解的准确性，很难利用生物信息学手段将细胞核DNA和细胞器DNA分离开，成为目前藻类DNA相关工作的瓶颈因素。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，实现通过生物信息学手段分离获得高质量的核DNA和细胞器DNA，主要流程包括材料的培养，分离细胞核，利用脉冲场电泳分分离核DNA和细胞器DNA，利用荧光定量技术检测质体、线粒体和核DNA中的含量，利用高通量测序技术检测质体、线粒体和核DNA的含量。该方法有效解决了藻类DNA中细胞核DNA和细胞器DNA的分离难题及藻类DNA提取过程中多糖多酚干扰现象，具有分离DNA纯度高、操作精准度高、成本低等优势，对促进藻类基因学发展及藻类优良藻种的选育具有重要意义。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，具体包括以下步骤：

（1）材料的培养：

把培养至成体的材料用灭菌的海水洗刷3次，然后用吸水纸吸干材料，称量储存待用，每次实验需要5g材料。

（2）分离细胞核：

①取5g材料在液氮中用研钵和研杵研磨，然后迅速地移动至50ml预冷的1xHB缓冲液中；在4℃孵育30分钟，每隔5分钟轻轻搅拌；

②将提取液用500目筛绢过滤以除去未消化的组织；

③选用10μm的网格，通过过滤除去细胞碎片；

④将滤液分装到离心管中，然后在2000g/min、4℃条件下离心20分钟；

⑤离心完以后弃上清，然后再次加入1xHB缓冲液清洗细胞核至无色，细胞核悬浮在750μl的1xHB缓冲液中；

⑥用等体积的1.4%低熔点琼脂糖包埋分离的细胞核；

⑦将形成的胶块放在4℃孵育1小时；

⑧然后用20倍体积的含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液在65℃条件下裂解切成条的胶块，裂解时间48小时；

⑨去除裂解缓冲液，加入20ml的1mol/L的EDTANa₂去除裂解液中的蛋白酶；

⑩最后将胶块保存在0.5M的EDTANa₂中待用；

（3）利用脉冲场电泳分离细胞核DNA和细胞器DNA：

①制备一块1%的琼脂糖凝胶，将包埋的含有细胞核的胶块填充在点样孔；

②设置脉冲场电泳的分离条件为:分离片段的范围大小为100-1000kb，电压为120，转角60°，分离12小时，在凝胶成像系统中观察电泳结果；