[发明专利]一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr‑1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

多粘菌素属于阳离子多肽抗生素家族，有A、B、C、D、E五种，抗菌谱相互类似而范围宽广，通常被认为是对抗耐多药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线，临床上常用的是多粘菌素B（polymyxin B）和多粘菌素E（colistin，黏菌素）。

近年来，发现了一个新的基因mcr-1，可使细菌对多粘菌素产生高度耐药性，其广泛存在于取自中国南方的猪和患者的肠杆菌科细菌中，包括具有流行可能性的菌株。已知，mcr-1基因产物属于磷酸乙醇胺转移酶家族，能够催化磷脂酰乙醇胺转移到脂质A的第四个磷酸基团上，使得脂质A的结构发生改变，从而降低了多粘菌素E与脂多糖的亲和力，介导多粘菌素耐药。mcr-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以水平基因转移的方式在不同菌株中进行遗传物质的交换，这意味着mcr-1基因介导的耐药性可以在细菌中相互传播。

各项研究表明，截止至2016年底，mcr-1基因已经在不少于16个国家中被发现，包括东南亚、柬埔寨和马来西亚的7个国家，9个欧洲国家。特别注意的是，质粒传播的mcr-1基因至少存在于3个肠道菌种中（大肠杆菌、沙门氏菌和克雷伯氏肺炎菌），宿主包括至少三种家禽和家畜（鸡、猪和牛），从而引发了公众对于其全球传播和扩散的担忧。因此，mcr-1基因的检测对于监控耐药细菌的爆发，指导患者感染用药具有重要作用。

对于mcr-1基因的检测，传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的检测方法具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组；

本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒；

本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

内引物1：5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’；

内引物2：5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’；

外引物1：5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’；

外引物2：5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’；

环引物1：5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’；

环引物2：5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’。

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所示的LAMP引物组。

作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为：(6～8)：(1～2)：(3～4)。

作为上述试剂盒的改进，还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。

作为上述试剂盒配方的优选，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

作为上述试剂盒配方的优选，LAMP反应液含有：10 mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSO₄水溶液、5 mM 甜菜碱，四者的体积比为(6～8)：（4～5）：（2～3）：（8～10）。

作为上述试剂盒配方的优选，显色剂为SYBR GREENⅠ。

作为上述试剂盒配方的优选，阳性对照为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的质粒，阴性对照为DEPC水。

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品DNA；

（2）利用LAMP引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应；