[发明专利]通过DNA链杂交和表面增强拉曼技术检测汞离子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及汞离子检测领域，具体地说，涉及一种通过DNA链杂交和表面增强拉曼技术检测汞离子的方法。

背景技术

汞作为一种常见的金属，在工业中用途广泛，但其造成的污染，对人体和环境都有很大危害。由于汞单质具有挥发性，可通过多种渠道扩散于水和空气中，并氧化成二价汞离子；汞离子被人体摄入后，会造成严重的神经毒性、遗传毒性和免疫毒性；而由汞离子引起的环境和健康问题也促进了检验方法的发展，人们开始尝试各种方法对水溶液中的汞离子进行定量分析。

传统的检测汞离子的方法主要有化学比色法和原子吸收光谱法，其检测灵敏度低，干扰因素多，检测结果的稳定性差、准确度低。近年来逐渐兴起利用生物传感器检测汞离子的方法，主要通过含有胸腺嘧啶的DNA与汞离子的特异性结合，形成T-Hg²⁺-T复合物，再将可检测的相关标记结合于DNA上，进而对相关标记进行检测；然而，目前的研究人员所设计生物传感器的DNA链种类多，反应过程中易出现副反应及非主链杂交反应，导致检测干扰增加，灵敏度降低，进而使得汞离子的检测限不能达到检测要求。

因此，亟待设计一种检测干扰小且灵敏度高的汞离子检测方法。

发明内容

基于现有技术的不足之处，本发明提供一种通过DNA链杂交和表面增强拉曼技术检测汞离子的方法，有效解决低浓度汞离子无法检测的难题，且保证了检测的准确度。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

通过DNA链杂交和表面增强拉曼技术检测汞离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)金纳米颗粒的合成：将0.01％氯金酸加热至沸腾，充分搅拌下加入柠檬酸钠溶液，持续加热20min回流冷凝，待反应溶液颜色变化稳定后停止加热，保持回流至反应溶液温度降至室温，于棕色瓶中4℃保存备用；

(2)生物条形码的合成：对信号链DNA进行活化，向活化后的信号链DNA中加入步骤(1)中合成的金纳米颗粒，遮光轻微震荡24h；使用NaCl老化12h，加入链霉亲和素反应1h，再用Tris-HCl缓冲溶液洗涤并分散，4℃保存备用；

(3)捕获链DNA的固定：使用咪唑-盐酸将磁性微球清洗干净，依次加入EDC和NHS，活化30min；然后加入捕获链DNA，轻微震荡16h；对固定有捕获链DNA的磁性微球进行磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤；加入BSA反应30min，并重复用Tris-HCl缓冲溶液洗涤三次，将洗涤后的磁性微球分散于Tris-HCl缓冲溶液中；

(4)靶标链DNA的固定：将靶标链DNA和不同浓度的汞离子加入到步骤(3)制得的溶液中，轻微震荡反应2h，磁性分离，用Tris-HCl缓冲溶液洗涤并分散；

(5)引发链DNA的杂交反应：将引发链DNA加入步骤(4)制得的溶液中，轻微震荡反应2h，磁性分离，用Tris-HCl缓冲溶液洗涤并分散；

(6)DNA杂交链式循环放大反应：将末端修饰有生物素的发卡DNA链H1及发卡DNA链H2混合均匀，加入到步骤(5)制得的溶液中，轻微震荡2.5h，磁性分离，用Tris-HCl缓冲溶液洗涤并分散；

(7)拉曼信号的检测：将步骤(2)中合成的生物条形码加入到步骤(6)制得的溶液中，轻微震荡且避光反应1h，磁性分离，用Tris-HCl缓冲溶液洗涤并分散制成检测溶液；将检测溶液均匀分散于金片上，蒸干液滴，于激光共聚焦拉曼显微镜下进行检测，记录拉曼信号强度，并且根据汞离子浓度和拉曼信号强度绘制工作曲线，通过所述工作曲线对所需检测的样品进行定量分析。

进一步地，所述信号链DNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述捕获链DNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述靶标链DNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述引发链DNA核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述发卡DNA链H1核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述发卡DNA链H2核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

进一步地，所述步骤(1)中金纳米颗粒合成过程中使用的容器均经王水泡制24h，并且使用去离子水清洗干净，烘干密封备用。

进一步地，所述步骤(1)中合成的金纳米颗粒pH值为8，粒径为20nm。

进一步地，所述步骤(2)中的信号链DNA的活化过程为：向1×10^-5M信号链DNA中加入10mM TCEP，活化反应1h。