[发明专利]眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种眼镜蛇毒细胞毒素‑4N的纯化制备方法，先采用DEAE‑SepharoseCL‑6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG‑50凝胶层析柱、Macro‑prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素‑4N活性最高的峰作为下步分离的样品。研究表明，应用本发明可以获得电泳纯度的CTX‑4N，其纯度高，活性高；HSC‑T6增殖抑制和凋亡实验证明，CTX‑4N对HSC‑T6细胞有杀伤作用，提示肝纤维化发展过程CTX‑4N会有抗肝纤维化的作用，具有重要的药用价值。

技术领域

本发明属于眼镜蛇毒细胞毒素领域，尤其涉及一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N(CTX-4N)的纯化制备方法及其应用。

背景技术

眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的毒液，其化学成分复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物活性。眼镜蛇细胞毒素(Cytotoxin，CTX)又称眼镜蛇心脏毒素(Cardiototxin)，是眼镜蛇毒的重要活性物质之一，约占蛇毒蛋白25％～40％，具有心脏毒、抑制骨吸收、引起可兴奋组织去极化、抗菌等生物活性，并诱导多种肿瘤细胞凋亡，不同区域不同蛇种蛇毒中含有组分的生物效应不尽相同。

从眼镜蛇中分离纯化CTX是研究其理化性质、毒性反应、药理作用、作用机制等的必要前提。在分离纯化CTX方面，国内外学者大都采用阳离子交换柱层析和凝胶过滤相结合的方法进行分离纯化，据此发现了CTX-I，CTX-II，CTX-III，CTX-IV(SEQ.ID.No.2)，CTX-V等细胞毒素，然而，此种方法中，由于柱效的影响因素繁多，且很难加以控制，故重复性差，分离纯化后所得产品中往往含有其他蛋白物质，从而将影响细胞毒素生物活性的研究。

肝纤维化是慢性肝病损伤后，肝脏自我修复的一个过程`，造成肝纤维化的原因是大量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏内沉积，改变了肝脏的结构，破坏了肝脏的生理功能；而使ECM过多的在肝脏累积的原因是肝星状细胞HSC的激活，激活的HSC细胞会产生大量的ECM；过多的ECM会使肝脏发生纤维化，继续发展为肝硬化，肝功能衰竭等疾病。因此在肝纤维化的过程中HSC细胞有至关重要的作用，如何抑制其激活或者使其发生凋亡在抗肝纤维化过程中有着重大关联。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、可控的眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

眼镜蛇毒细胞毒素-4N在制备抗肝纤维化药物中的应用。

上述眼镜蛇毒细胞毒素-4N按以下方法制备：先采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素-4N活性最高的峰作为下步分离的样品。

选取眼镜蛇毒细胞毒素-4N活性最高的峰采用CCK-8实验方法，通过对HSC-T6细胞增殖抑制作用，用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验。

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法，包括以下步骤：

(1)DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱洗脱分离；

(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；

(3)Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱分离。