[发明专利]眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用

权利要求书

1.眼镜蛇毒细胞毒素-4N在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述眼镜蛇毒细胞毒素-4N为序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

2.一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法，其特征在于所述眼镜蛇毒细胞毒素-4N为序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，该方 法包括以下步骤：

(1)DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱洗脱分离；

(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；

(3)Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱分离；

步骤(1)按以下操作进行：将DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱用A液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱中，采用B液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择具有抑制作用的峰进行脱盐透析，冻干备用；所述A液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5缓冲液；所述B液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5+0.5M NaCl的缓冲液；

所述样品的配制按以下操作进行：称舟山眼镜蛇毒粗毒1g，加入10ml A液溶解，将其放在4℃冰箱中待其全部溶解后，10000rpm，4℃离心，20min；用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用；

步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml 0.02M PBSpH7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用；SephadexG-50凝胶层析柱用0.02M PBS pH7.5的缓冲液平衡12h，将前述蛋白样品上样于平衡好的SephadexG-50柱中，采用0.02M PBS pH7.5按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率显著的峰进行脱盐透析，冻干备用；

步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1ml PB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prep High S柱，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱保存备用；所述平衡用的PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137:63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5；缓冲液B为0.02M PB pH6.5+0.5MNaCl；所述溶解用的PB缓冲液pH4.0。