[发明专利]iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法

说明书

本发明公开了一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法。该无血清诱导培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基。通过使用上述iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法可以将iPS细胞定向诱导分化为内胚层祖细胞，从而为iPS诱导分化为成体的各个细胞提供了技术支持。同时该无血清诱导培养基及诱导方法均没有用到血清，从而有效地避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其是涉及一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法。

背景技术

组织工程是近几年的研究热点，但是种子细胞很难在体外进行大规模的培养扩增，种子细胞来源问题阻碍了组织工程的发展。自体的种子细胞来源有限，异体的种子细胞存在排斥反应，胚胎干细胞又存在伦理问题，因此从尿液中收集尿液细胞，将尿液细胞诱导成为iPS细胞(诱导性多能干细胞)，iPS细胞再诱导成为各个成体细胞，可以解决组织工程的种子来源问题。从尿液中获得细胞，方便快捷，不用通过创伤获取，来源广泛。

目前iPS细胞诱导分化为成体细胞诱导方案主要有单纯细胞因子诱导、共培养诱导、拟胚体培养基诱导等。然而单纯细胞因子诱导效率低，共培养诱导存在免疫原性，拟胚体存在不定向三个胚层诱导的特点，定向分化率低。成体的各个细胞来源于胚层的不同胚层，因此，要高效获得某种成体细胞，亟需高效定向获得某一种胚层。

发明内容

基于此，有必要提供一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法。

一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；其中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-160ng/ml的Activin A以及终浓度为5-18ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为5-18ng/ml的HGF以及终浓度为15-28ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.05-0.2mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为75-180μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.15-0.7μg/ml的氢化可的松、终浓度为25-100μg/ml的胰岛素、终浓度为5-20ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-180μg/ml的转铁蛋白。

在其中一个实施例中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-120ng/ml的Activin A以及终浓度为8-12ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为15-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-12ng/ml的HGF以及终浓度为15-25ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.08-0.12mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为80-120μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.2-0.6μg/ml的氢化可的松、终浓度为50-80μg/ml的胰岛素、终浓度为8-12ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-120μg/ml的转铁蛋白。

在其中一个实施例中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为100ng/ml的Activin A以及终浓度为10ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为20ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为10ng/ml的HGF以及终浓度为20ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.1mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为100μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.4μg/ml的氢化可的松、终浓度为60μg/ml的胰岛素、终浓度为10ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为100μg/ml的转铁蛋白。