[发明专利]iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法

权利要求书

1.一种用于诱导iPS细胞分化成内胚层祖细胞的试剂盒，其特征在于，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基，所述第一阶段培养基、所述第二阶段培养基以及所述第三阶段培养基均为无血清培养基；其中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-160ng/ml的Activin A以及终浓度为5-18ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为5-18ng/ml的HGF以及终浓度为15-28ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.05-0.2mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为75-180μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.15-0.7μg/ml的氢化可的松、终浓度为25-100μg/ml的胰岛素、终浓度为5-20ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-180μg/ml的转铁蛋白。

2.如权利要求1所述的用于诱导iPS细胞分化成内胚层祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-120ng/ml的Activin A以及终浓度为8-12ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为15-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-12ng/ml的HGF以及终浓度为15-25ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.08-0.12mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为80-120μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.2-0.6μg/ml的氢化可的松、终浓度为50-80μg/ml的胰岛素、终浓度为8-12ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-120μg/ml的转铁蛋白。

3.如权利要求2所述的用于诱导iPS细胞分化成内胚层祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为100ng/ml的Activin A以及终浓度为10ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为20ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为10ng/ml的HGF以及终浓度为20ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500ml DMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.1mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为100μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.4μg/ml的氢化可的松、终浓度为60μg/ml的胰岛素、终浓度为10ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为100μg/ml的转铁蛋白。

4.一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法，其特征在于，依次使用权利要求1-3中任一项所述的第一阶段培养基、第二阶段培养基及第三阶段培养基对iPS细胞分为三个阶段进行诱导分化。

5.如权利要求4所述的iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法，其特征在于，所述三个阶段分别为诱导分化的第1天至第3天、第4天至第7天以及第8天至第11天，在每个阶段培养时，均隔天换培养基。

6.如权利要求5所述的iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法，其特征在于，还包括在诱导分化之前，将iPS细胞通过培养板和离心的方法形成单细胞团拟胚体的步骤。

7.如权利要求6所述的iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法，其特征在于，还包括如下iPS细胞复苏及单细胞形成的步骤：将P30的iPS细胞进行复苏，用mTeSR1无基质细胞培养，在70-80％汇合度时，用Accutase消化液消化为单细胞，再将所述单细胞按照每个培养板孔0.5-1×10⁶个iPS细胞加入所述培养板孔中以形成所述单细胞团拟胚体。