[发明专利]利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种类肾器官的培养方法，具体地说，是关于一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的方法。

背景技术

干细胞是能够分化为多种细胞类型的细胞。人诱导多能干细胞(hiPSCs)可以分化为多种细胞类型，现在已经可以直接分化形成脑、心、肠、肝、肺、肾等类器官。尽管在构建组织特异性单位与类器官方面已经取得显著成果，但在体外保存这种细胞聚集体仍是个巨大挑战。细胞培养需要氧气与养分，但体外构建的3D类器官缺乏血管系统，所以其寿命、大小和成熟度通常受限制。

人类的肾脏包含多达200万个负责血液滤过的上皮肾单位。为了满足排泄和PH值、电解质及体液平衡的调节等功能，再生肾脏需要诱导20多种不同的细胞类型。

目前，尚未有在体外利用人多能干细胞构建类肾器官的相关技术报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种体外构建类肾器官的技术。

一方面，本发明提供了一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的培养方法，其是在体外利用人多能干细胞构建类肾器官。具体而言，本发明的方法包括以下步骤：

1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；

2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；

3)细胞达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基(STEMdiff APEL Medium)，进行人多能干细胞的培养分化；

4)收集细胞置于Transwell过滤器表面，制作类肾器官。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，是用移液枪吸取所述的基质胶，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3～6小时或在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。具体地，以6孔板的1个孔为例，通常情况下，吸取1ml的基质胶即可均匀分布覆盖于培养皿底部。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，所述基质胶为Basement Membrane Matrix或hESC qualified Matrigel。所述基质胶可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司、In Vitro Technologies等。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，所述的无饲养层培养基为完全培养基。例如，可以是PSC-Easy完全培养基，具体地，其包括以下组分：基础培养基DMEM/F-12；添加剂：碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/mL。所述完全培养基可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司等。通常情况下，以6孔板的1个孔为例，可加入1～2ml的无饲养层培养基。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞(hiPSCs)。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，对于这类干细胞称之为诱导多能干细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，人多能干细胞接种前经过以下处理步骤：

根据需要进行解冻；或已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻；

使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面的过程可以按照如下操作进行：