[发明专利]利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2

说明书

本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K₂和纳豆激酶的方法，包括以下步骤：菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落在试管培养基，进行培养；制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；纳豆激酶、维生素K₂的生产：配置联产发酵培养基，待配置联产发酵培养基冷却后，取制备的种子液，接种，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K₂的生产；纳豆激酶、维生素K₂的分离和提取：将发酵液离心后，上清与沉淀分离，向上清中添加无机高分子絮凝剂，并选用壳聚糖作为助凝剂，将上清中维生素K₂和纳豆激酶分离。本发明具有提高了原料的利用率且适合于工业生产的优点。

技术领域

本发明属于生物化工领域，尤其涉及利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K₂和纳豆激酶的方法。

背景技术

纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，经过发酵后可以得到多种生理活性物质，维生素K₂，纳豆激酶，生物表面活性剂，生物多糖等。维生素K₂(menaquinone，简写为MK，甲萘醌类)，是一种具有叶绿醌生物活性的萘醌基团衍生物，脂溶性维生素。依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，MK共有14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数。MK-4，MK-7，MK-9生物活性均大幅高于维生素K₁。维生素K₂具有治疗和预防骨质疏松症，预防肝硬化进展为肝癌，强化肝脏的解毒功能，及治疗维生素K₂缺乏性出血症等作用。维生素K₂具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效。但是国内外的维生素K₂的生产，存在着原料成本高，产率低的问题，使得维生素K₂的工业化生产受到了极大的制约，因此，降低发酵成本，或者增加发酵过程中的附加值，对维生素K₂的发酵生产将起到极大的促进作用。

纳豆激酶(nattokinase简写为NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶，是在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。它由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，纳豆激酶能显著溶解体内外血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性。与其他具有纤溶活性的酶相比，纳豆激酶更容易被肠道吸收，溶栓作用也强于纤溶酶、尿激酶(UK)和蚓激酶，纤溶活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶在药品，保健品方面有极大的应用价值，但是也存在着发酵成本高，产率低的缺点。

分析国内外的已有文献，纳豆芽孢杆菌可以发酵维生素K₂，也可以发酵纳豆激酶。本发明首次发明了一种利用纳豆芽孢杆菌同时高产维生素K₂和纳豆激酶的新方法，可以有效的提高纳豆芽孢杆菌发酵过程中附加值，提高发酵产率。

发明内容

本发明提供了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K₂和纳豆激酶的方法，采用优化得到联产培养基，使纳豆芽孢杆菌联产维生素K₂和纳豆激酶的产量均达到较高水平，初步解决了维生素K₂和纳豆激酶发酵过程中成本高，产量低的问题，并提高了原料的利用率促进了工业化进程。

本发明通过以下技术手段达到上述技术效果：一种联产维生素K₂和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K₂和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K₂和纳豆激酶进行分离；包括以下步骤：

(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落划线至试管培养基，进行培养；