[发明专利]CHO细胞表达牛传染性病气管炎病毒gD蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO细胞系及牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，它以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征。该病毒还可引起母牛生殖系统损害，导致流产、死胎等，有时还会引发肠炎、小牛脑炎、眼结膜炎和角膜炎等。该病对奶牛的产奶量、牛群的肥育率及繁殖力均有较大的影响，并且急性的IBR呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎。该病于20世纪50年代初最早报道于美国，但目前在世界范围内流行。我国1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、黄牛和水牛均有IBRV感染。流行病学调查显示，我国14个养牛主要省份IBRV平均感染率为33.3％，给我过养牛业造成巨大的经济损失。

IBRV基因组由一个长独特区(UL,106kb)和一个短独特区(Us,l0kb)及Us区两侧的重复序列IRs和TRs组成，IBRV基因组为双股线性DNA分子，约138kb。整个基因组编码33个结构蛋白和15个非结构蛋白，其中四个糖蛋白gB、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原，而gD蛋白是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，是IBRV的主要结构蛋白，同时也是IBRV复制的必需基因，是刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白，它不但能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，因此gD是制备IBRV检测抗原和疫苗的首选基因。

CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，CHO细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。

CHO细胞类型较多，如：DG44、DXB11、CHO-K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

本发明成功构建并筛选了稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO细胞株，克服了表达牛传染性鼻气管炎病毒gD囊膜糖蛋白对细胞毒性作用。该细胞株表达gD蛋白水平高、易于纯化、生产，并且低剂量的gD蛋白抗原能在牛体内诱导产生高水平的免疫反应。该细胞株表达抗原所制备的疫苗可为牛传染性鼻气管炎病毒的预防提供新型、高效的预防制剂，它将对我国乃至世界范围内牛传染性鼻气管炎病毒的预防控制发挥重要作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产的牛传染性鼻气管炎病毒的亚单位疫苗的制备方法和应用。