[发明专利]一种小分子蛋白或多肽的制备方法及融合蛋白

说明书

本发明提供一种小分子蛋白或多肽的制备方法，所述方法包括：（a）构建基因工程菌株，该基因工程菌株包含具有融合蛋白编码核酸序列的重组表达载体，所述融合蛋白为F‑L‑多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽‑1、人胰高血糖素样肽‑1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP‑1或其类似物、GLP‑2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽；（b）培养所述基因工程菌株，以表达所述融合蛋白；和（c）纯化所述融合蛋白并通过蛋白酶切割得到具有生物活性的所述小分子蛋白或多肽。本发明的方法克服了小分子蛋白或多肽难以表达的缺点，为此类蛋白表达提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及一种小分子蛋白或多肽的制备方法，还涉及该制备方法中使用到的编码序列、重组表达载体和融合蛋白。

背景技术

根据国际糖尿病联盟发布的糖尿病地图(第7版)统计数据显示，2015年全球糖尿病患者人数已经高达4.15亿，平均每11个人中就有1个人患病，预计到2040年全球糖尿病患者将增至6.42亿。2015年全球共有500万人死于糖尿病，平均每6秒钟就有1人死亡。对各个国家和地区的患病率和发病趋势的估计显示，中国糖尿病患者数较2013年增加1120万，达1.096亿，居全球首位。根据目前的发展趋势，预计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿。全球健康费用的12％被用于糖尿病治疗及并发症预防，2015年花费达到6730亿美元。因此，研究疗效好，价格便宜的糖尿病治疗药物刻不容缓。

胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。GLP-1有GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺两种活性形式，分别是由31个氨基酸和30个氨基酸组成的小肽。然而，人体自身产生的天然GLP-1极易被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，其血浆半衰期不足2分钟，在临床上不能成药。

GLP-1类似物不仅具有GLP-1相同的药理作用，还具有更长的血浆半衰期，可以显著降低血糖水平及修复胰岛细胞功能。GLP-1类似物能模仿人GLP-1葡萄糖浓度依赖性的降糖活性，抑制患者胃肠运动和排空，避免口服类降糖药和胰岛素类降糖药的不足，如体重增加、长期血糖浓度及HbA1c水平控制不佳、严重低血糖等不良反应，显著提高患者的生活质量，是治疗2型糖尿病的重要药物。

艾塞那肽(Exendin-4)是一种GLP-1类似物，由美国礼来公司开发，是肠促胰岛素类似物家族的第一个成员。艾塞那肽是从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中分离得到的，由39个氨基酸组成，与GLP-1氨基酸序列具有约53％的同源性，在哺乳动物体内，该多肽的生理功能与GLP-1相似，能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌。艾塞那肽对二肽基肽酶IV不敏感，体内半衰期长达2-3个小时，对2型糖尿病具有较好的临床治疗效果。临床上主要用于治疗二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍和磺酰脲类联合应用不能很好控制血糖的II型糖尿病。

利拉鲁肽(Liraglutide)也是一种GLP-1类似物，由丹麦诺和诺德公司开发，由31个氨基酸和一条脂肪酸侧链组成，其氨基酸序列与人GLP-1具有97％的序列同源性。与天然GLP-1不一样，利拉鲁肽不会被二肽基肽酶降解，皮下给药后血浆半衰期约13小时。利拉鲁肽适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。每日注射一次，可在任意时间注射，无需根据进餐时间给药。

索玛鲁肽(semaglutide)也是一种GLP-1类似物，由31个氨基酸和一条脂肪酸侧链组成，由丹麦诺和诺德公司开发，是在利拉鲁肽基础上进行优化得到。它采用谷氨酸-2*OEG连接子，18碳二羧酸脂肪酸链，序列上34位突变为精氨酸，8位丙氨酸突变为非天然氨基酸Aib。三期临床研究证实，索玛鲁肽的半衰期为40h，远高于利拉鲁肽的15h，给药频率可达到一周一次。