[发明专利]哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物

说明书

本发明公开了哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物。本发明提供了本发明提供用于哈蟆油真伪鉴别的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。本研究通过对位点特异性PCR进行条件优化，实现了在40min内简单、快速、直观的鉴别哈蟆油及其常见混伪品的目的，有助于实现哈蟆油药材现场、准确、快速鉴定。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物。

背景技术

哈蟆油(Ranae oviductus)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporariachensinensis David)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4类，其它伪品类型少见。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。

随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。

随着分子生物学的发展，分子鉴定技术已成为中药材传统鉴别方法的有益补充。有关哈蟆油的PCR鉴别方法已有报道，但是由于哈蟆油药材本身遇水膨胀，给哈蟆油的DNA提取带来极大的困难，提取过程复杂，成功率低，制约了该方法的深入应用。

快速PCR在保证PCR反应特异性和准确性的前提下，通过缩短反应时间来达到快速检测目的，尤其是和荧光检测技术相结合，进一步提高了检测效率，有望实现中药材的现场、快速检测。快速PCR技术和产物荧光检测的实现，对引物设计有严格的要求。为达到快速扩增的目的，设计引物时上下游引物距SNP位点尽可能近，PCR产物应尽可能短；引物Tm值与延伸温度接近，以减少PCR反应的升降温温差。为达到使用荧光检测的目的，引物设计应避免引物二聚体对检测结果的影响，这就要求引物质量要好，扩增过程中无引物二聚体的产生；使用的酶质量要好，能有效抑制引物二聚体的形成；有些情况下引物二聚体是不可避免的，可以通过调整酶、引物用量、加入PCR增强剂等方法，减少其对荧光检测结果的影响。

近年来，快速PCR方法已成功用于金银花，蛇类，太子参，人参、西洋参等中药材的真伪鉴别。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于哈蟆油真伪鉴别的引物对。

本发明提供的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；

所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。

上述引物对中，所述DNA片段A的核苷酸序列为序列5；

或，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下1)或2)：

1)为序列1所示的单链DNA分子；

2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)为序列2所示的单链DNA分子；

4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。

本发明第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助哈蟆油的PCR试剂。