[发明专利]一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及外周血肿瘤细胞检测领域，具体是一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法。

背景技术

前列腺癌是当今男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在世界范围内位居恶性肿瘤发病的第四位，在中国位居恶性肿瘤发病第六位且发病率呈逐年上升趋势。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万。前列腺癌发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁，成为严重危害男性身体健康的重要杀手。

循环肿瘤细胞（CTC）是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。远处转移是前列腺癌患者死亡的主要原因，而CTC被视为肿瘤转移的“种子”，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。现有的捕获和富集CTC的方法主要有基于CTC的物理性状进行捕获，如密度、分子大小等物理性状，或基于CTC表面生物标志物如EpCAM（上皮细胞粘着分子）等进行富集，如经FDA批准使用的Cellsearch检测平台，Cellsearch平台是利用EpCAM对CTC正向富集，然后用CK18荧光染色鉴定。但是基于密度、分子大小等物理性质对CTC进行捕获，容易导致CTC漏筛，得到假阴性结果。而由于不同肿瘤的异质性，EpCAM也越来越多的被证实在前列腺癌的肿瘤细胞表面并不一定具有很好的表达效果。因此需要一种具有更高特异性和敏感性的前列腺癌外周循环肿瘤细胞捕获技术。

近年来，一种结合阴性富集技术和免疫荧光原位杂交技术的CTC方法被应用于CTC的检测，该方法不依赖于细胞表面EpCAM分子的表达，如何选择特异性的探针识别前列腺癌CTC是本技术的重要技术难点，前列腺特异性膜抗原（PSMA）是一类在前列腺组织中特异性表达的抗原分子，因其是前列腺癌影像诊断及治疗的重要靶标近年来越来越为研究者所关注。研究者发现PSMA在前列腺的良性增生组织、正常组织、癌组织中均有表达，且表达强度依次上升，在前列腺癌组织中表达强度最高；在前列腺癌的淋巴结转移灶、骨转移灶中表达也呈阳性。随着研究的深入，研究结果都表明PSMA有望成为高特异性和高敏感性的前列腺疾病监测的肿瘤标志物，但是目前尚未有好的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，具体步骤如下：

步骤一，采集外周血液样本：取一只采血管，抽取前列腺癌患者的外周全血，如需寄送样品在常温放置并且在48小时内检测；

步骤二，血细胞分离：将采血管配平后置于水平离心机中，离心机在常温下离心5-8分钟，然后小心吸取上清至细胞层；向采血管中加细胞清洗液并且上下颠倒混匀，另取一只离心管并且加淋巴细胞分离介质，将混匀后的细胞小心转移到淋巴细胞分离介质上层，再加细胞清洗液，润洗后加在上层，重复润洗一次；将离心管放在离心机中，离心机在常温状态下离心4-8分钟，离心后分为三层，底层红色的为红细胞，中间略带白色的中间层主要是白细胞和CTC，上层是黄色的血浆，吸取红细胞以上的全部液体，去除红细胞层；将磁珠混合均匀，逐滴加磁珠，水平摇床在常温下摇动15-22分钟；取一只离心管，加淋巴分离介质，将含有磁珠的悬浮液转移至分离介质上层，将离心管放在离心机中，离心机在常温下离心5-10分钟，再吸取底层分离介质及以上液体，用大磁力架吸附2-3分钟；

步骤三，抗体染色：抗体在抗体稀释液中配制，CD45-Alexa 594抗体和PSMA-Alexa 488抗体浓度均为1mg/ml，各自取CD45-Alexa 594抗体和PSMA-Alexa 488抗体1μl后加入抗体稀释液198μl，然后步骤二中的细胞中加200 μL 的稀释后抗体，避光常温孵育20 分钟，孵育后加细胞清洗液至14 mL, 离心机离心2-5分钟，去除上清液至100 μl；

步骤四，细胞固定：细胞与固定液按照1:1的比例混合，吹打混匀细胞，均匀涂在载玻片上的方框内，在28-34摄氏度的烘箱中无风风干过夜；

步骤五，乙醇脱水：将玻片插入100%乙醇脱色缸内1-4分钟，擦去玻片背面和边缘的乙醇残留，用吹风机的冷风吹干；

步骤六，探针孵育：加10ul的CEP8探针，盖上盖玻片并且在四周加封片胶封片，先在72-80摄氏度下预杂交8-12分钟；然后在35-40摄氏度下杂交15-18小时；