[发明专利]一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法

权利要求书

1.一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，采集外周血液样本：取一只采血管，抽取前列腺癌患者的外周全血，如需寄送样品在常温放置并且在48小时内检测；

步骤二，血细胞分离：将采血管配平后置于水平离心机中，离心机在常温下离心5-8分钟，然后小心吸取上清至细胞层；向采血管中加细胞清洗液并且上下颠倒混匀，另取一只离心管并且加淋巴细胞分离介质，将混匀后的细胞小心转移到淋巴细胞分离介质上层，再加细胞清洗液，润洗后加在上层，重复润洗一次；将离心管放在离心机中，离心机在常温状态下离心4-8分钟，离心后分为三层，底层红色的为红细胞，中间略带白色的中间层主要是白细胞和CTC，上层是黄色的血浆，吸取红细胞以上的全部液体，去除红细胞层；将磁珠混合均匀，逐滴加磁珠，水平摇床在常温下摇动15-22分钟；取一只离心管，加淋巴分离介质，将含有磁珠的悬浮液转移至分离介质上层，将离心管放在离心机中，离心机在常温下离心5-10分钟，再吸取底层分离介质及以上液体，用大磁力架吸附2-3分钟；

步骤三，抗体染色：抗体在抗体稀释液中配制，CD45-Alexa 594抗体和PSMA-Alexa 488抗体浓度均为1mg/ml，各自取CD45-Alexa 594抗体和PSMA-Alexa 488抗体1μl后加入抗体稀释液198μl，然后步骤二中的细胞中加200 μL 的稀释后抗体，避光常温孵育20 分钟，孵育后加细胞清洗液至14 mL, 离心机离心2-5分钟，去除上清液至100 μl；

步骤四，细胞固定：细胞与固定液按照1:1的比例混合，吹打混匀细胞，均匀涂在载玻片上的方框内，在28-34摄氏度的烘箱中无风风干过夜；

步骤五，乙醇脱水：将玻片插入100%乙醇脱色缸内1-4分钟，擦去玻片背面和边缘的乙醇残留，用吹风机的冷风吹干；

步骤六，探针孵育：加10ul的CEP8探针，盖上盖玻片并且在四周加封片胶封片，先在72-80摄氏度下预杂交8-12分钟；然后在35-40摄氏度下杂交15-18小时；

步骤七，清洗：撕去封片胶，将玻片插入到装有探针杂交冲液液的染色缸内，在染色缸中晃动1-2分钟，镊子平移推去盖玻片，在探针杂交缓冲液中清洗1-2次，每次5分钟；然后在探针清洗液中清洗2-4次，每次5分钟；

步骤八，封片：采用封片剂进行封片，盖上盖玻片即可。

2.根据权利要求1所述的检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述封片剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚和甘油的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述磁珠采用CD45免疫磁珠。