[发明专利]结直肠癌易感基因变异文库构建方法

说明书

本发明涉及一种结直肠癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据结直肠癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.计算得到各引物对的判断参数R，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液进行文库PCR扩增，得到测序文库。本发明的结直肠癌易感基因变异文库构建方法所构建的文库测序通量高，灵敏度强，特异性强，能够用于检测游离DNA低频突变的。

技术领域

本发明涉及一种结直肠癌易感基因变异文库构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。

新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion Torrent^TM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究核医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的告诉发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。

SNPs(单核苷酸多态性)指在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一直，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类DNA中常见的变异形式，数以百万存在整个人类的基因组中，部分SNP能够导致蛋白质氨基酸编码改变或基因表达调控改变。

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一。在西方国家其发病率居恶性肿瘤的第2～3位,随着我国人民生活水平的不断提高和饮食习惯的改变,我国结直肠癌的发病率也在逐年升高,已跃居第3～5位。结直肠癌的预后与早期诊断密切相关,多数早期结直肠癌可以治愈,5年生存率可达90％,而晚期则不足10％,内镜是早期诊断的主要手段。大量研究证实遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素己证实存在微效基因剂量效应，即微效基因作用的累加才可以形成明显的表型综合效应。因此，对疾病的多个易感基因及突变位点进行检测至关重要，约占整个基因组中遗传突变的92％。对结直肠癌的易感基因的研究并不需要对全基因组测序，而只需要对特定的几个基因进行研究，目标序列捕获测序的出现，使得对基因组塔顶区域的研究成为可能。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。高通量多基因检测可以一次性检测多个基因的多种变异类型，同步解析靶向用药、化疗用药和遗传风险，综合指导肠癌患者的个体化治疗，最大化患者获益可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种测序通量高，灵敏度强，特异性强，基于二代测序平台技术，能够用于检测游离DNA低频突变的结直肠癌易感基因变异文库构建方法。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种结直肠癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：

A.根据结直肠癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；

B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：

R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；