[发明专利]一种特异性抗Kif18A蛋白695位丝氨酸磷酸化抗体的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种特异性抗Kif18A蛋白695位丝氨酸磷酸化抗体的制备方法与应用，特异性抗Kif18A蛋白S695磷酸化抗体对深入研究其磷酸化状态对Kif18A自身功能发挥的调节以及对整个细胞有丝分裂过程的影响具有重要意义，该抗体制备及应用为揭示Kif18A分子的磷酸化状态在细胞周期有丝分裂过程中的基本调节机制，初步分析其与癌症发生的关系，对深刻理解细胞有丝分裂的基本规律，以及基于Kif18A分子靶点的肿瘤防治策略的设计提供了研究基础。

技术领域

本发明涉及生物医药技术应用，尤其涉及一种特异性抗Kif18A蛋白695位丝氨酸磷酸化抗体的制备方法与应用。

背景技术

驱动蛋白分子的研究是近几年生命科学领域的又一热点。对其功能的揭示不仅有助于深入理解正常细胞生长、组织发育及器官功能，也可为许多疾病发生发展基本机制的揭示提供新思路。染色体驱动蛋白分子Kif18A在细胞有丝分裂期，定位于动粒和纺锤体，参与染色体整列、纺锤体形成和胞质分裂过程。因此制备特异性抗Kif18A蛋白S695磷酸化抗体对深入研究其磷酸化状态对Kif18A自身功能发挥的调节以及对整个细胞有丝分裂过程的影响具有重要意义。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种特异性抗Kif18A蛋白695位丝氨酸磷酸化抗体的制备方法与应用。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种Kif18A-S695磷酸化多肽，具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列

Cys-Ser-Val-Gln-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-Ile-Val-Tyr-Thr-Pro-Glu-Asp，其中第七位的(即第二个)丝氨酸进行磷酸化，即外带一个磷酸根(pSer)。

一种Kif18A-S695磷酸化抗原，由所述的Kif18A-S695磷酸化多肽与血蓝蛋白KLH交联制备形成，按照下列具体步骤进行：

(1)将G-25交联葡聚糖800rpm,5min离心,弃上清，加入与葡聚糖等体积的PBS缓冲液混匀；

(2)向25ml玻璃瓶中加入134微升KLH，1866微升pH为6.0的PBS，最终KLH终浓度为10mg/ml；

(3)称0.006g MBS，溶于200微升DMSO；

(4)在搅拌情况下，将步骤(3)的MBS分散体系缓慢加入到步骤(2)的KLH分散体系中，采用移液枪枪头尖伸至液面以下的方式进行缓慢加入，持续搅拌30min；

(5)取一个25ml塑料移液管(作为层析柱)，用剪刀剪去上口，玻璃纤维堵住下口，将步骤(1)中G25交联葡聚糖充分混匀倒入管子，纯葡聚糖约5-6ml，使用50ml pH为7.4的PBS清洗蛋白亲和层析柱；

(6)将步骤(4)中经搅拌分散均匀的KLH-MBS混合液加入步骤(5)准备的柱子；

(7)待KLH-MBS混合液全部进入柱子后，用pH 7.4PBS洗1次，同时开始用1.5ml的EP管在下面接液体，每管1ml，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，选浓度最高的3管液体进行混合，用于下述多肽交联；

(8)将10mg多肽(SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：Cys-Ser-Val-Gln-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-Ile-Val-Tyr-Thr-Pro-Glu-Asp，其中第七位的丝氨酸进行磷酸化)加入200微升pH 7.4PBS溶解，将溶解的多肽加入1.5ml经过步骤(7)得到的KLH混合物，搅拌1h；