[发明专利]一种特异性抗Kif18A蛋白695位丝氨酸磷酸化抗体的制备方法与应用

权利要求书

1.一种Kif18A-S695磷酸化多肽，其特征在于：具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，其中第七位即第二个丝氨酸进行磷酸化。

2.一种Kif18A-S695磷酸化抗原，其特征在于：由Kif18A-S695磷酸化多肽与血蓝蛋白KLH交联制备形成，Kif18A-S695磷酸化多肽具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，其中第七位即第二个丝氨酸进行磷酸化。

3.根据权利要求2所述的一种Kif18A-S695磷酸化抗原，按照下列具体步骤进行：

(1)将G-25交联葡聚糖800rpm,5min离心,弃上清，加入与葡聚糖等体积的PBS缓冲液混匀；

(2)向25ml玻璃瓶中加入134微升KLH，1866微升pH为6.0的PBS，最终KLH终浓度为10mg/ml；

(3)称0.006g MBS，溶于200微升DMSO；

(4)在搅拌情况下，将步骤(3)的MBS分散体系缓慢加入到步骤(2)的KLH分散体系中，采用移液枪枪头尖伸至液面以下的方式进行缓慢加入，持续搅拌30min；

(5)取一个25ml塑料移液管(作为层析柱)，用剪刀剪去上口，玻璃纤维堵住下口，将步骤(1)中G25交联葡聚糖充分混匀倒入管子，纯葡聚糖约5-6ml，使用50ml pH为7.4的PBS清洗蛋白亲和层析柱；

(6)将步骤(4)中经搅拌分散均匀的KLH-MBS混合液加入步骤(5)准备的柱子；

(7)待KLH-MBS混合液全部进入柱子后，用pH 7.4PBS洗1次，同时开始用1.5ml的EP管在下面接液体，每管1ml，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，选浓度最高的3管液体进行混合，用于下述多肽交联；

(8)将10mg多肽(SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：Cys-Ser-Val-Gln-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-Ile-Val-Tyr-Thr-Pro-Glu-Asp，其中第七位即第二个丝氨酸进行磷酸化)加入200微升pH 7.4PBS溶解，将溶解的多肽加入1.5ml经过步骤(7)得到的KLH混合物，搅拌1h；

(9)将经过步骤(8)交联的物质用pH 7.4PBS透析12小时，每12h更换透析液(pH7.4PBS)，每次800ml；取出透析后的液体，加入pH 7.4PBS至总体积10ml，每管1ml分装，-80度冻存。