[发明专利]藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法

说明书

本发明首先提供腔轮虫CoI基因在作为用于藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用，以及如SEQ ID No.1‑3所示的DNA分子标记和特异性引物组；接着提供一种藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法，采用上述的特异性引物组，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR。本发明的技术效果是找到一种分子标记并设计出特异性引物，可以有效的将腔轮虫在藻类培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了试验时间，简化了操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。

技术领域

本发明涉及微生物分子检测技术领域，尤其是涉及在藻类大规模培养中对腔轮虫进行早期监测的qPCR方法。

背景技术

腔轮虫是在藻类大规模培养中存在的一种重要污染原生动物，它们是一类广泛的淡水轮虫。目前已经在小球藻、栅藻以及血球藻的大规模培养中发现并爆发，一经感染，可使藻类大规模培养在2至4天内完全溃败，导致“泡汤”，从而给藻类的大规模培养带来极大危害。因此对于藻类培养中存在的腔轮虫的早期监测和分子鉴定方法的确定至关重要。

目前对腔轮虫的研究比较局限，仅在于对其的分类，中却多样性及群落结构等方面对其进行研究，而几乎没有对于其对大规模藻类培养造成的危害进行研究，在环境条件不利于生产繁殖的时候便形成休眠孢囊存在，对于在大规模藻类培养很难在显微镜中观察到它们的存在，并且传统的形态学观察灵敏度低，在原生动物存在数量很大的前提下才可以完成。而DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)存在检测效率低，当DNA含量很低的情况下不能被检出，检测结果出现假阳性的现象，也经常会影响对实际情况的判断。并且采用以上方法对腔轮虫进行检测的时候，就说明存在数量已经很大，而这种存在量已足以使藻类大规模培养发生完全溃败。因此，对腔轮虫的早期监测和分子鉴定的方法尤为重要。

随着分子生物学检测技术的发展，在原生动物的检测手段方面已发展迅速，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)以其检测速度快，灵敏度高，特异性强的特点在原生动物的分子检测中和贝类病原检测中已得到广泛的应用。在贝类上的原生动物检测灵敏度以达到30拷贝。因此，对于腔轮虫的检测急需要荧光定量PCR这种灵敏度高、特异性强、检测速度快的检测手段。

发明内容

本发明的目的是为了在藻类培养早期快速监测到污染物的存在，提供一种腔轮虫的荧光定量PCR检测方法。该方法较传统的PCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大量的样品检测，并对腔轮虫进行定量，从而为藻类培养早期腔轮虫污染的检测和监控提供有效方法。

本发明的第一个技术目的是提供腔轮虫CoI基因在作为用于藻类培养中危害腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。由于原生动物基因序列相似度较大，如直接采用DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)，经常出现检测效率低，检测结果出现假阳性的现象。而本发明经过反复研究后，发现采用腔轮虫CoI基因的特异性区域片段作为分子标记进行qPCR，可以有效的将腔轮虫在藻类培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。同时，本发明以CoI基因作为分子标记，还具有以下特点：(1)CoI基因作为分子标记可以使用很短的序列就可以进行区分，而其他的分子标记所涉序列比较长，比较复杂且容易误判；(2)CoI基因能够准确区分出物种差异，具有特异性；(3)CoI基因存在于线粒体，每个生物细胞内有若干个线粒体，检测时可以放大，具有很高灵敏度。

本发明的第二个技术目的是提供一种DNA分子标记，包含腔轮虫CoI基因的三段特异性区域序列，其序列分别如SEQ ID No.1-3所示。

接着提供一组引物组，包含三对引物，分别用于特异性扩增序列SEQ ID No.1-3，各自的上下游引物序列如下(如SEQ ID No.4-9所示)：

(1)CoI-1F：5’-TAATGTTAGGGGTTGCTGAT-3’；