[发明专利]抗BTLA蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

免疫细胞表面的辅助受体的激活对机体免疫的调节起到非常重要的作用，其中CD28/B7 配体受体家族成员研究的比较多，如：CTLA4，PD1和B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)等。他们都起到了负向调节免疫应答的作用。

BTLA又名CD272，是最近才被发现的CD28家族的一员，属于Ig超家族成员。主要表达在激活后的B、T淋巴细胞表面。同PD-1一样，BTLA的胞内区域也有一个免疫受体Tyr抑制基序，通过和配体HVEM结合后能抑制T细胞的活化。因而在肿瘤浸润的淋巴细胞中，BTLA 的表达量可反映免疫抑制的状态。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对BTLA蛋白的单克隆抗体对IHC检测BTLA表达水平具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的BTLA蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2016年4月27日，保藏编号为CGMCC No.12284。

本发明还提供了一种特异性结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据BTLA ORF核苷酸序列(BTLA ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，870bp；BTLA氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增BTLA ORF第1bp位到第867bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建BTLA氨基酸序列第1位到第289位的重组表达质粒pCMV6-rBTLA；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCATGAAGACATTGCCTGCCATG下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTACTCCTCACACATATGGATGCA

(2)BTLA重组蛋白的表达与纯化：将BTLA重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的BTLA重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的BTLA重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗BTLA特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为Umab61，亚型鉴定为IgG2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得BTLA单克隆抗体Umab61。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

本发明将所述单克隆抗体Umab61与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明所述单克隆抗体Umab61特异性结合BTLA蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体Umab61在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体 Umab61，可检测组织细胞中BTLA的表达状况。