[发明专利]雷公藤TwKS与TwCPS3在制备贝壳杉烷型二萜化合物中的应用

说明书

技术领域

本发明通过构建TwCPS3和TwKS真核及原核表达载体，通过体外酶促和酵母发酵的方法成功合成了16α-贝壳杉烷，其与赤霉素的生物合成相关。涉及雷公藤生长发育调控和活性成分的合成，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)是一味中草药，被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。现有研究表明贝壳杉烷型二萜是萜类天然产物家族中的主要组成部分，这类分子通常表现出抗菌、抗肿瘤、抗疟、抗病毒等多种重要生物活性。从中药活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分，特别是探寻贝壳杉烷型二萜在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，能够为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

赤霉素是一种四环双萜化合物，在植物的生长调节方面具有非常重要作用的物质。现有研究表明赤霉素在植物的种子萌发，茎的生长，开花和结果具有重要的调节作用。贝壳杉烷型二萜是一类双萜化合物，其具体种类和含量对于下游赤霉素的生物合成具有重要影响。从贝壳杉烷型二萜化合物前体到赤霉素生物合成途径的解析有助于调控雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤红素等活性成分的生物合成。

发明内容

本发明通过对雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks进行表达载体的构建，成功合成了赤霉素的前体物16α-贝壳杉烷，这对雷公藤甲素等活性成分的生物合成调控具有重要的意义。

具体而言本发明将克隆得到的Twcps3和Twks基因的cDNA克隆到原核表达载体pMAL-c2X，构建带有Twcps3和Twks基因的重组表达载体；转入E.coli表达宿主菌，通过诱导后，表达产物经初步纯化后，加入到以GGPP为底物的体外酶促反应体系中，正己烷萃取反应产物，采用GC-MS检测到贝壳杉烷型二萜化合物的生成，经过对GC-MS图谱的分析结果表明，TwCPS3和TwKS联合使用能够将GGPP转化为贝壳杉烷型二萜类化合物，出乎意料的是，所述贝壳杉烷型二萜类化合物中除了目前已知的赤霉素前体对映贝壳杉烯以外，还能够产生ent-16α贝壳杉烷，另外产物中还发现一定量的泪杉醇。

通过将Twcps3和Twks基因的ORF克隆到真核表达载体pESC-Trp，构建带有Twcps3和/或Twks基因的重组表达载体并通过定点突变等方法，通过酵母BY-T20发酵生成产物，利用气相色谱-质谱联用技术，分析Twcps3和Twks基因的功能。研究结果表明，真核表达的TwCPS3和TwKS能够将GGPP转化为贝壳杉烷型二萜，并且ent-16α贝壳杉烷的产量更高。本发明对雷公藤的生长发育以及活性成分的生物合成调控具有重要意义。

本发明提供一种雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3和雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS在制备贝壳杉烷型二萜中的应用，其特征在于以牻牛儿基焦磷酸GGPP为底物，催化产生贝壳杉烷型二萜化合物。

其中，所述的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3的序列为SEQ ID NO：1，雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS的序列为SEQ ID NO：3。

本发明还提供雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜中的应用，其特征在于重组表达Twcps3和Twks基因获得TwCPS3和TwKS用于制备贝壳杉烷型二萜，其中雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3的序列为SEQ ID NO：2，雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks的序列为SEQ ID NO：4。

本发明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜中的应用其中所述Twcps3和Twks基因通过原核表达或真核表达获得TwCPS3和TwKS，优选将所述基因进行真核表达。

本发明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜中的应用，利用原核表达载体pMAL-c2X分别构建带有Twcps3或Twks基因的重组原核表达载体；利用真核表达载体pESC-Trp分别构建带有Twcps3或Twks基因的重组表达载体。