[发明专利]雷公藤TwKS与TwCPS3在制备贝壳杉烷型二萜化合物中的应用

权利要求书

1.雷公藤柯巴基焦磷酸合酶T_wCPS3和雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS在制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷中的应用，其特征在于以牻牛儿基焦磷酸GGPP为底物，催化产生贝壳杉烷型二萜化合物ent-16α贝壳杉烷；

其中，所述的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3的序列为SEQ ID NO：1，雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS的序列为SEQ ID NO：3。

2.雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷中的应用，其特征在于重组表达Twcps3和Twks基因获得TwCPS3和TwKS用于制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷，其中雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3的序列为SEQ ID NO：2，雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks的序列为SEQ ID NO：4。

3.权利要求2所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷中的应用，其中所述Twcps3和Twks基因通过原核表达或真核表达获得TwCPS3和TwKS。

4.权利要求2或3所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤贝壳杉烯合酶基因Twks在制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷中的应用，利用原核表达载体pMAL-c2X分别构建带有Twcps3和Twks基因的重组原核表达载体；利用真核表达载体pESC-Trp分别构建带有Twcps3和Twks基因的重组真核表达载体。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于产物中还包括泪杉醇。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于产物中还包括泪杉醇。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3/或其基因Twcps3，与雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS/或其基因Twks同时使用或先后使用。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3/或其基因Twcps3，与雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS/或其基因Twks同时使用或先后使用。

9.一种酶催化制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷的方法，其包括以下步骤：

(1)以牻牛儿基焦磷酸GGPP为底物加入雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3，正己烷萃取3次，弃有机相、取水相，氮气吹干后进行脱磷；

(2)向步骤(1)中脱磷后获得的产物加入雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS进行反应，正己烷萃取3次，取正己烷相用氮气吹干；

(3)对步骤(2)获得的产物进行GC-MS分析，第13.96分的峰即为ent-16α贝壳杉烷；

其中，所述的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3的序列为SEQ ID NO：1，雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS的序列为SEQ ID NO：3。

10.一种酶催化制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷的方法，其包括以下步骤：

(1)将Twcps3基因表达盒和Twks基因表达盒构建到同一个真核表达载体pESC-Trp上，构建获得重组质粒pESC-(Twcps3+Twks)，转化酵母筛选获得重组酵母菌；

(2)将PCR鉴定阳性的重组酵母菌进行诱导培养，收集菌液加入等体积正己烷，超声破菌、萃取、硫酸钠干燥、旋蒸浓缩至近干，过滤后4℃保存备用；

(3)对步骤(2)获得的产物进行GC-MS分析，第13.96分的峰即为ent-16α贝壳杉烷；

其中，所述的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3的序列为SEQ ID NO：1，雷公藤贝壳杉烯合酶TwKS的序列为SEQ ID NO：3。

11.如权利要求9所述酶催化制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷的方法，其特征在于GC-MS分析的步骤中第12.99分的峰为泪杉醇，第13.03分的峰为ent-贝壳杉烯。

12.如权利要求10所述酶催化制备贝壳杉烷型二萜ent-16α贝壳杉烷的方法，其特征在于GC-MS分析的步骤中第12.99分的峰为泪杉醇，第13.03分的峰为ent-贝壳杉烯。