[发明专利]一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法

说明书

本发明公开了一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法，其包括选取发育正常的雌花，待开花2‑5天后，挑选与其花相连的南瓜幼果，缓慢注射含有外源基因表达载体的农杆菌悬浮液，使菌液渗入果肉；瞬时转化后2‑5天，即可观察外源基因在南瓜果实中的表达情况，从而分析基因在果实中的功能和作用。本发明采用的果实瞬时转化，具有遗传转化简单、难度小、效率高等优点，为有效分析果实相关基因功能、启动子活性分析、亚细胞定位、制备蛋白等奠定基础。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法。

背景技术

南瓜（Cucurbita moschata）是热带亚热带的一年生草本植物，果实含有丰富的营养功能代谢物质，是研究果实营养功能物质合成的理想生物材料。由于瓜类的整个遗传改良方法不成熟，尤其是中国南瓜（C. moschata）遗传改良暂无报道，而传统的育种技术已不能满足对果实品质研究的需要。瞬时表达（transient express）是导入外源基因后在短时间内检测到其表达产物和表达功能的外源基因表达方式。农杆菌介导的瞬时表达方法已经在很多转基因植物中应用，与传统转基因过程相比，其周期短、安全、转化效率高、操作简单。但目前主要是利用农杆菌介导在叶、根、茎等组织，较少在南瓜这样的大型果实进行转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法，包括如下步骤：

（1）将外源基因插入植物表达载体中；

（2）将步骤（1）得到的表达载体转化到农杆菌感受态细胞中，得到含有植物表达载体的农杆菌悬液；

（3）选取发育正常的雌花，待开花2-5天后，挑选与其花相连的南瓜幼果，缓慢注射步骤（2）制备得到的农杆菌悬浮液，使菌液渗入果肉；

（4）瞬时转化后2-5天，即可观察外源基因在南瓜果实中的表达情况。

作为优选的，所述植物表达载体包括：pBI121或pMOG800。

所述外源基因为衣藻CRBKT基因。

作为优选的，步骤（2）的具体操作为：将含有外源基因的植物表达载体添加到农杆菌感受态细胞悬液中，冰上放置25-35min，然后将细胞悬液在40-45℃水浴中热激50-70s，迅速移出冰上放置冷却。

作为优选的，步骤（3）所述农杆菌悬浮液的浓度为OD₆₀₀=0.3-0.5。

所述农杆菌悬浮液的组成包括：MES、MgCl₂及AS。

作为优选的，所述农杆菌悬浮液的组成包括：10 mM MES、10mM MgCl₂及200μM AS。

作为优选的，所述农杆菌悬浮液的注射量为80-100μL。

本发明的有益效果是：

本发明的目的在于提供一种将外源基因转入南瓜果实进行瞬时表达的方法，以农杆菌为介导，通过构建植物过表达载体，使外源基因在果实中表达，从而分析基因在果实中的功能和作用。本发明采用的果实瞬时转化，具有遗传转化简单、难度小、效率高等优点，为有效分析果实相关基因功能、启动子活性分析、亚细胞定位、制备蛋白等奠定基础。

附图说明

图1为植物过表达载体pBI121-CRBKT的结构示意图；

图2为实施例中外源基因CRBKT(SEQ: NO.1)在南瓜幼果中的表达情况；