[发明专利]药用激肽原酶及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及药用激肽原酶（KLK1）及其制备方法和应用，所述激肽释放酶中不含有组分KLK1c。猪胰脏来源的组织激肽释放酶是由3种不同糖基化程度的组分所组成，蛋白电泳分析是呈3条条带，依照分子量由大到小依次命名为KLK1b、KLK1a、KLK1c，其中，组分KLK1c的特征是糖基化程度最低，在三种组分中的比活最低。本发明提供的去除了KLK1c组分的组织激肽释放酶，和现有市场上的猪胰脏来源的组织激肽释放酶相比，纯度及稳定性更高，生物活性更高，药效好且副作用更小。同时，本发明提供了一种猪组织激肽释放酶的精纯方法，解决了KLK1b，KLK1a和KLK1c分离困难、无法产业化的问题。

技术领域

本发明涉及蛋白类药物，特别是药用激肽原酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。

背景技术

激肽原酶，又称激肽释放酶(kininogenase)或血管舒缓素(kallidinogenase)，它是属于丝氨酸蛋白酶的一种，存在于各种组织和生物液体中，催化大分子前体物(激肽原，Kininogen)释放生物活性肽(激肽，Kinin)。激肽原酶的生理效应包括使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加，使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加，适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有治疗作用。同时，激肽原酶也可以作为活化因子，使纤溶酶原激活成纤溶酶，将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用，并用于治疗血栓、预防血栓再形成(G.M.Yousef,E.P.Diamandis Clin Biochem,2003(36):443-452)。体外研究显示，激肽原酶对离体动脉具有舒张作用，并可抑制血小板聚集、增强血细胞变形能力和氧解离能力。动物试验显示，激肽原酶静脉注射可增加麻醉犬椎间、颈总和股动脉血流量，增加麻醉犬后肢、家兔肌肉血流量。因此，激肽原酶在人类微循环障碍及轻-中度急性血栓性脑梗死等疾病的治疗中具有较高的应用价值。

国内市场上现有的激肽原酶药物分为两类：一类是从猪胰脏中提取的激肽原酶，它来源广泛。另一类是从新鲜人尿中提取精制的人尿激肽原酶。其中从猪胰脏提取的激肽原酶的相关产品目前市场上主要有丽珠医药、上海第一生化、沈阳济世、河南灵佑、南昌万华、济南维尔康，常州千红。但是市售猪胰激肽原酶注射液使用时注射部位常有红肿、疼痛的症状，并且，申请人也在大鼠急性缺血性脑卒中实验中发现有大鼠在用药后死亡的情况，因此，申请人推测在现有市售产品中有副作用较大的成分存在。

发明内容

解决的技术问题：本发明主要解决了如何进一步提高猪胰脏来源激肽原酶产品质量的问题，提供了一种活性更高、稳定性更好的激肽原酶；同时解决了猪胰脏来源激肽原酶分离纯化困难，无法产业化的问题，提供了一种可以应用于大规模生产制备的分离纯化KLK1b，KLK1a和KLK1c单组分的方法。

技术方案：

猪胰脏来源的激肽原酶是由3种不同糖基化程度的组分所组成，蛋白电泳分析是呈3条条带，依据分子量由大到小依次命名为KLK1b、KLK1a、KLK1c。

目的之一是提供一种激肽原酶(KLK1)，所述激肽原酶中不含有组分KLK1c，所述KLK1c是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最低的条带。

优选的，上述激肽原酶(KLK1)，其由组分KLK1b、KLK1a中的一种或两种组成。所述组分KLK1b是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最高的条带，所述KLK1a是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量第二的条带。

最优选的，上述激肽原酶(KLK1)，其为KLK1b。

本发明的另一个目的是，提供一种激肽原酶KLK1的精纯方法，包括如下步骤：

步骤1，激肽原酶溶液用阴离子交换色谱柱纯化，梯度洗脱；