[发明专利]一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种茶树类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记，该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。本发明还提供茶树类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用以及应用方法。本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速准确地鉴定和筛选出具有高儿茶素指数（CI值2.5）的茶树资源。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用、应用方法。

背景技术

儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根据儿茶素B环的羟基数目、C环上2,3位同分异构体、C环上3位是否连接没食子酸等可以划分为若干种组分。根据儿茶素B 环的羟基数目，儿茶素主要可以分为B环二羟基儿茶素和三羟基儿茶素，其中表没食子儿茶素(EGC) 和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 属于B 环三羟基儿茶素，而表儿茶素(EC) 和表儿茶素没食子酸酯(ECG) 属于B环二羟基儿茶素。在红茶发酵过程中，每个茶黄素分子的形成需要1个二羟基儿茶素和1个三羟基儿茶素，即儿茶素指数CI（即二羟基儿茶素/三羟基儿茶素）值为1的鲜叶原料最有利于茶黄素的形成。国外已有多项研究发现，儿茶素指数CI值与红茶品质密切相关。

但专利申请人研究发现，与肯尼亚等优质红茶主产国家相比，我国不乏有高儿茶素资源，但这些资源所含的儿茶素EGCG占比偏大（约60%），CI值多在0.2-0.5（Jin et al.,2014）。近期，在贵州的少量茶树资源中，发现了CI值高达5的茶树。利用高儿茶素指数的资源与其它高儿茶素总量的资源进行杂交，有望培育出儿茶素总量高、儿茶素组分比例合适的优质红茶品种，高儿茶素指数茶树资源对改良我国茶树品种有较大的潜在应用价值。但迄今为止，国内外茶叶儿茶素含量的鉴定大都采取生化测定方法，该方法受茶树发育时期和生存环境影响、且需要一定量的茶树叶片，无法做到对野外资源的准确鉴定和杂交子代个体的早期鉴定。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因上游调控区域序列存在的插入缺失（InDel）突变开发的分子标记，及其应用在鉴定和筛选高儿茶素指数茶树中的技术方案。高儿茶素指数茶树指的是CI值大于2.5的特异茶树材料。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示,所述的高儿茶素指数茶树指的是CI值大于2.5的特异茶树材料。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

利用功能标记对各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG上游837bp至上游686bp的DNA片段进行PCR扩增和琼脂糖凝胶分析，如扩增产物显示为152bp的片段则该茶树确定为常规资源，如扩增产物显示为138bp的片段则该茶树确定为高儿茶素指数茶树。

所述的应用方法，其特征在于所述的PCR扩增的体系和反应程序为：PCR反应体系：32 µL ddH₂O，2 µL DNA，5 µL 10×PCR Buffer，4 µL 25 mM MgCl₂，5 µL 2 Mm dNTP，1µLKOD-Plus-Neo酶，10 µM 的上、下游引物各3 µL；PCR扩增程序为：94℃ 2 min，然后进行以下循环，94℃ 15 sec，56℃ 25 sec，68℃ 5 sec，共 35个循环；最后68℃延伸2min；扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。