[发明专利]用于表达AIF及整合有AIF的重组单链抗体的菌株及该菌株的应用

说明书

本发明提供了一种用于表达AIF及整合有AIF的重组单链抗体的菌株及该菌株的应用。该技术方案利用单链抗体T18与肿瘤内皮细胞标志分子TEM1特异性结合的特性，构建了AIF‑T18蛋白复合物，从而实现凋亡诱导因子AIF对肿瘤细胞的靶向给药，提升其对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。本发明首先以pET302质粒为载体构建了整合有AIF‑T18表达基因的重组质粒，而后以原核表达系统E.coli BL21为宿主将重组质粒导入其中，得到了具有稳定表达能力的重组菌株。在此基础上，本发明围绕该重组菌的特性设计了高效的蛋白表达方法，并针对以包涵体形式存在的蛋白表达产物匹配了适宜的变性、复性、纯化条件，从而实现了AIF‑T18的有效制备。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一涉及基因重组技术以及重组质粒在宿主细胞中的蛋白表达，具体涉及一种用于表达AIF及整合有AIF的重组单链抗体的菌株及该菌株的应用。

背景技术

内皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一个被糖基化修饰的80.9KDa的蛋白核心区组成，修饰后成熟的糖蛋白大约在175KDa。TEM1是近期发现的人类肿瘤标记物之一，其对肿瘤的细胞生长血管生成浸润及转移有重要作用。

TEM1外部分由五个球状结构域(N端的C型凝集素结构域，寿司样结构域，和三个表皮生长因子(EGF)样重复)和一个粘蛋白样区组成，其中核心蛋白大量唾液酸化与血栓调节蛋白相似。对于成体组织，TEM1的表达分布是这样的：子宫>肾小球>输卵管血管>心和肺>其他组织；另外，在内皮祖细胞中TEM1表达量相对很少。然而，在以下肿瘤中TEM1都有高表达，如肉瘤，脑肿瘤，乳腺癌，皮肤癌、结肠癌，且实验表明在卵巢癌中，TEM1表达与肿瘤的浸润、预后密切相关。因此，TEM1在正常组织不表达或者低表达，而在肿瘤血管组织高表达的特点，预示了TEM1作为肿瘤诊断和治疗的靶标分子的潜力。

细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一类存在于线粒体内外膜之间的保守的黄素蛋白，可诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其转录产生的mRNA的长度为2.4kb，编码产生的蛋白质有三个不同长度的可变剪接体，它们的氨基酸数分别为613、609和326。除可诱导细胞凋亡外，AIF兼具氧化还原酶的活性。

当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后，线粒体膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打开，允许AIF从线粒体释放到胞浆，并进入细胞核中，和另一个线粒体蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核内DNA凝集并断裂成50kb大小的片段。

在介导细胞凋亡过程时，AIF有两个方面的作用：一是可以作为细胞凋亡的起始因子，二是可以作为细胞凋亡的直接效应因子。在正常的情况下，AIF存在于线粒体中，可以清除细胞内的自由基从而阻止细胞凋亡；当细胞受到凋亡刺激后。AIF首先从线粒体出来，然后转移至细胞质中，最后转移到细胞核中发挥促进细胞凋亡的作用。

本发明中采用实验室前期筛选的单链抗体T18作为生物导航，而T18是利用酵母抗体库筛选分离出可同时结合人类和鼠类TEM1的高亲和力、特异性单链抗体，通过实现其与人源化毒素AIF的融合表达，实现肿瘤细胞凋亡的最终目的。

而现今肿瘤治疗的两大方法一是以抗体的免疫疗法，二是以化学药物的化学疗法为基础。抗体免疫疗法靶向性强，但是由于其相对分子量大，因此限制了实体瘤的治疗效果。小分子的化学药物对于癌细胞有高强度的杀伤效果，但由于不能分辨正常细胞，对正常细胞也具有一定杀伤作用，副作用比较明显。因此，在临床上对于癌症的治疗，提出了抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADC)的一类新颖的治疗药物，基于单克隆抗体技术研究而成的特异性识别作用结合化学药物的高强度杀伤作用，实现特异性杀伤肿瘤的良好效果。

发明内容