[发明专利]用于表达AIF及整合有AIF的重组单链抗体的菌株及该菌株的应用

权利要求书

1.一种用于表达整合有AIF的重组单链抗体的菌株，其特征在于该菌株是由以下方法制备的：

1)取序列如SEQ ID No.2所示的Aif-T18表达基因，通过酶切方式与pET302质粒连接，得到重组质粒pET302-Aif-T18；

2)取步骤1)所得的重组质粒pET302-Aif-T18，转入E.coli BL21中，得到重组菌pET302-Aif-T18-B21，即为所述用于表达整合有AIF的重组单链抗体的菌株。

2.应用权利要求1所述菌株制备整合有AIF的重组单链抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：

A)取权利要求1所述菌株接入含氨苄青霉素的LB培养基中，35～39℃震荡培养过夜；

B)取步骤A)培养得到的菌液，以3～7％(v/v)的接种量接种至新鲜的LB培养基中，培养至菌液OD值为0.6～0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8～1.2mM，而后于35～39℃震荡培养3～5h；

C)固液分离取沉淀，加入20～25mL的Binding Buffer重悬菌体，超声破碎，而后固液分离取沉淀；

D)从步骤C)所述沉淀物中收集包涵体，加入20～25mL的Binding Buffer重悬包涵体；

E)取步骤D)所得的包涵体溶解于蛋白变性液中，至其中包涵体蛋白的终浓度为30～50mg/mL，常温震荡3～5h，而后以12000～14000rpm的转速离心25～35min，取上清，将其以1:80～1:120的体积比加入至蛋白复性液中，在搅拌条件下、2～6℃环境中保持36～48h，浓缩后与His beads按1:3～1:5的体积比混匀，而后利用浓度为450～550mM的咪唑溶液洗脱蛋白，再利用PBS溶液透析。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤C)中所述超声破碎的条件为：每超声处理5s，停8s，如此重复95次，功率为200W，2个循环。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤C)中第二次固液分离的条件为：8000～12000rpm的转速离心8～12min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤D)中所述收集包涵体，是先用TritonX-100/EDTA Solution洗涤沉淀，离心后取灰白色沉淀即为包涵体。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤D)中Binding Buffer的用量与步骤C)中Binding Buffer的用量相等。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤E)中所述蛋白变性液是浓度为7.5～8.5M的尿素溶液；所述蛋白复性液是浓度为1.8～2.2M的尿素溶液。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤E)中所述混匀是在2～6℃条件下搅拌混合3～5h。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤E)完成后继续执行以下操作：取TEM1阴性细胞和TEM1阳性细胞，采用流式细胞仪检测所得蛋白产物与TEM1阴性细胞、TEM1阳性细胞的结合能力；采用MTT比色法检测所得蛋白产物对TEM1阴性细胞、TEM1阳性细胞的杀伤能力。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述TEM1阳性细胞是通过以下方法制备的：

m)获得TEM1片段：取质粒pCMV6-XL4-TEM1采用双酶切后胶回收获得TEM1片段；

n)构建-3Zf(-)-TEM1重组质粒：将步骤m)中获得的TEM1片段通过酶切连接的方法，连接到-3Zf(-)质粒中，即得到重组质粒-3Zf(-)-TEM1；

o)构建-3Zf(-)-TEM1-Top10重组菌株：将步骤n)所得的-3Zf(-)-TEM1重组质粒转入E.coli Top10中，获得重组菌株-3Zf(-)-TEM1-Top10；

p)构建pIRES-TEM1-EGFP重组质粒：从步骤o)中获取的重组菌株中得到含有TEM1的-3Zf(-)-TEM1重组质粒，通过酶切连接的方法，连接到pIRES-EGFP质粒中，即得到重组质粒pIRES-TEM1-EGFP；

q)构建pIRES-TEM1-EGFP-Top10重组菌株：将重组质粒pIRES-TEM1-EGFP转入E.coliTop10中，获得重组菌株pIRES-TEM1-EGFP-Top10；

r)构建TEM1阳性MS1细胞：从步骤q)中提取pIRES-TEM1-EGFP重组质粒电转进入TEM1阴性细胞MS1，通过G418筛选得到TEM1阳性细胞系。