[发明专利]一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法

说明书

本发明提供了一种米糠谷蛋白来源的生物活性肽，其序列为KHNRGDEF；本发明的活性肽具有抗氧化活性，可用于制备增加抗氧化功效的食品和保健品。本发明从米糠谷蛋白的酶解产物中分离获得一种具有体外抗氧化活性的多肽，通过碱提酸沉法提取粗谷蛋白，之后再分级提取，接着选用离子交换层析和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将所得米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，得到抗氧化活性肽产品，其酶解条件为[E]/[S]1.5%‑1.8%、pH10.0、温度50℃、时间4.2h，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP‑HPLC及分析型RP‑HPLC分离纯化得到所需的抗氧化活性肽纯品。本发明生产成本低、工艺简便、绿色环保，所得米糠活性肽具有合理氨基酸组成、低过敏性、安全可靠等特点，且其具有较好的自由基清除能力，具有良好的抗氧化功效。

技术领域

本发明涉及一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法。

背景技术

米糠是大米生产工厂中产生较多的副产物，其蛋白质氨基酸组成与大米中蛋白质氨基酸组成相似，氨基酸组成合理，均为优质蛋白。我国每年工业生产都会产生大量的米糠，而其中大部分未得到有效利用，因此需要对米糠蛋白进行深加工以提高其附加值，实现资源充分利用。大米以及米糠中的蛋白溶解性差，严重影响其应用。而米糠中的分子量较小的肽段则具有较好的溶解性，且不同的肽段具有不同的功效，如抗氧化性、降血压、免疫活性等。大米抗氧化活性肽具有良好的自由基清除能力，在预防自由基诱发的心脑血管疾病方面有很大的开发潜力。大米活性肽对氧化损伤诱导的自由基有很好的清除作用，可提高人体细胞抗氧化能力。

经过调研，未见我国学者利用中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽的相关文献报道，因此中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽等研究领域尚处于空白阶段。本研究发现利用中性蛋白酶提取米糠蛋白中的大米活性肽具有清除自由基、抑制细胞氧化的作用，有效提高米糠的附加价值，实现米糠的高值化利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法，是以米糠为原料，利用中性蛋白酶制备具有抗氧化活性的肽产品，以实现米糠的高值化利用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述米糠抗氧化活性肽的分离制备方法是通过碱提酸沉法和Osborne分级提取脱脂米糠来获得米糠谷蛋白，然后选用离子交换和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将分离纯化后的米糠谷蛋白用中性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP-HPLC及分析型RP-HPLC分离纯化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述中性蛋白酶水解的条件为[E]/[S]1.5%—1.8%、pH值为10.0、温度为50℃、反应时间为4.2h。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

（1）谷蛋白的提取：脱脂米糠→加水并调pH值为9.0，料液比为1:10，所述料液比的单位为mL/g ，40℃水浴4h→离心→取上清液→pH值为4.0条件下酸沉→离心→取沉淀→水洗，调pH值为7.0→冷冻干燥→碱提米糠谷蛋白→Osborne分级提取，得到米糠谷蛋白；

（2）选用pH值为10.0，浓度为0.1 mol/L 的Na₂CO₃-NaHCO₃作为缓冲液对大米谷蛋白进行初步的分离；以pH值12.0，浓度为0.05 mol/L Na₂HPO₄-NaOH缓冲液溶解碱提米糠谷蛋白，利用 DEAE-52 阴离子交换层析介质对碱提米糠谷蛋白进行进一步分离纯化；

（3）制备米糠蛋白悬浮液，按中性蛋白酶/谷蛋白质量比为1.5%-1.8%的比例添加中性蛋白酶→调 pH 值为10.0→50℃下超级恒温水浴酶反应器中溶解 30min→酶解4.2h→灭酶→离心→取上清液→真空浓缩→冷冻干燥，得大米谷蛋白肽；