[发明专利]一种富集检测磷酸化蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及材料分析化学和有机化学领域，尤其涉及一种富集检测磷酸化蛋白的方法。

背景技术

蛋白质的磷酸化是一种可逆的翻译后修饰，在细胞的增殖、分化、信号传导以及转录与翻译、蛋白质复合体形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此，磷酸化蛋白成为了蛋白质组学研究的热点问题。天然样品中的磷酸化蛋白难以直接用于目前常用的质谱法检测。为解决该问题，改善质谱对磷酸化蛋白的信号响应，必须对磷酸化蛋白进行分离富集，这成为了磷酸化蛋白组学研究中的重要内容。目前由于完整磷酸化蛋白分离困难，磷酸化蛋白组学研究主要基于“自下而上”的策略，即先将蛋白无差别酶解成多肽链段，在肽段水平上鉴定其中的磷酸化位点，然后进行搜库、推理和拼接得到完整的磷酸化蛋白信息，这种方法虽然简单易行，但是所得蛋白水平的磷酸化信息离实际生物样品中的真实信息存在很大差距。因此，在蛋白水平上直接进行分离一直以来是磷酸化蛋白质组学研究者们所努力尝试但仍未解决的难题。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供了一种富集检测磷酸化蛋白的方法。该方法分离效率高，样品损失小，低成本。

本发明采用下的技术方案如下：

一种富集检测磷酸化蛋白的方法，该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如下：

其中R为羧基，硝基，甲基，甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；所述双组分共聚物层的厚度为50-100nm。

上述方案中，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

上述方案中，所述富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面所得到，具体过程如下：

1)在烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-5:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:4-20；

2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温70-90℃条件下进行原子转移自由基聚合反应12-36小时；

3)反应结束后，洗涤基底表面并在60-80℃下真空干燥，得到所述富集材料。

上述方案中，样品的上样量为富集材料与蛋白混合物的质量比例为400:1-2000:1，孵育温度为20-40℃。

上述方案中，所述磷酸化蛋白为α-酪蛋白、β-酪蛋白或卵清蛋白，非磷酸化蛋白为牛血清蛋白。

上述方案中，所述分散固相萃取模式的具体步骤如下：

1)先采用活化液和平衡液活化及平衡富集材料，将该富集材料与蛋白混合物以质量比例为100:1-1000:1混合，孵化0.5分钟-60分钟；分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀，其中磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的质量比为1:1-1:50；

2)采用pH＝0-7的有机溶液对沉淀清洗；

3)将清洗后的沉淀采用pH 3-7有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液；浓缩得到非磷酸化蛋白。

4)将清洗后的沉淀采用体积pH 0-3有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液，得磷酸化蛋白，上述过程的操作温度为20-40℃。

上述方案中，所述有机溶液、活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和去离子水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％-95％，有机酸的体积浓度为0.1％-5％。

上述方案中，所述活化液中有机溶剂体积浓度为10-30％，pH＝5-7。

上述方案中，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为30-70％，pH＝0-5。

上述方案中，所述色谱分析的参数设置如下：