[发明专利]一种富集检测磷酸化蛋白的方法

权利要求书

1.一种富集检测磷酸化蛋白的方法，其特征在于，该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如下：

其中R为羧基，硝基，甲基，甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；所述双组分共聚物层的厚度为50-100nm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面所得到，具体过程如下：

1)在烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-5:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:4-20；

2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温70-90℃条件下进行原子转移自由基聚合反应12-36小时；

3)反应结束后，洗涤基底表面并在60-80℃下真空干燥，得到所述富集材料。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品的上样量为富集材料与蛋白混合物的质量比例为400:1-2000:1，孵育温度为20-40℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化蛋白为α-酪蛋白、β-酪蛋白或卵清蛋白，非磷酸化蛋白为牛血清蛋白。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分散固相萃取模式的具体步骤如下：

1)先采用活化液和平衡液活化及平衡富集材料，将该富集材料与蛋白混合物以质量比例为100:1-1000:1混合，孵化0.5分钟-60分钟；分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀，其中磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的质量比为1:1-1:50；

2)采用pH＝0-7的有机溶液对沉淀清洗；

3)将清洗后的沉淀采用pH 3-7有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液；浓缩得到非磷酸化蛋白；

4)将清洗后的沉淀采用体积pH 0-3有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液，得磷酸化蛋白，上述过程的操作温度为20-40℃。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶液、活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和去离子水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％-95％，有机酸的体积浓度为0.1％-5％。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化液中有机溶剂体积浓度为10-30％，pH＝5-7。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为30-70％，pH＝0-5。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱分析的参数设置如下：

1)采用C4、C8或者C18反相色谱柱，填料直径1-20μm，孔径10-100nm，柱内径2-10mm，长度50-1000mm；

2)采用紫外或者二极管阵列检测器，检测波长范围为200-280nm；

3)采用流动相为甲醇/水或者乙腈/水的混合物再加0.1-0.5％三氟乙酸，其中有机相的比例为0％-70％，流速为0.05-2.0ml/min。