[发明专利]一种细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种应用LH‑PCR技术，制备细菌性阴道病的细菌基因指纹图谱的方法，以及应用该细菌基因指纹图谱进行细菌性阴道病临床精确诊断的用途。本发明所述的细菌基因指纹图谱能用于细菌性阴道病的临床快速诊断，避免传统的细菌分离培养的诊断不准确、操作繁琐、耗时长、工作量大以及高通量测序价格昂贵等缺点，能够准确、快速有效地检测阴道内的菌群分布状况。

技术领域

本发明涉及一种细菌基因指纹图谱的制备方法，具体的说涉及一种应用LH-PCR技术制备细菌性阴道病的细菌基因指纹图谱的方法。

背景技术

细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis，BV)是由细菌引起的阴道感染，是育龄期女性常见的下生殖道感染性疾病，其可引发多种不良妊娠结局，如自然流产、早产、羊水感染、产后子宫内膜炎和剖腹产切口感染及围产儿并发症等。近年来的研究发现，细菌性阴道病的复发和持续感染还能增加滴虫性阴道炎、白假丝酵母菌性阴道炎、宫颈癌和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的风险。

目前对细菌性阴道病的病因，特别是对细菌性阴道病患者的阴道菌群构成的差异，缺乏深入研究。以往使用的培养法并不能全面地反映阴道菌群的构成，导致对细菌性阴道病患者的病原菌研究受到局限，有时患者临床评价虽已是治愈状态，但其阴道菌群构成却还没有恢复到正常状态，致病菌仍存在，此时如仅通过临床评价停止治疗，则会导致细菌性阴道病复发，耽误疾病治疗，增加疾病的复发率。

随着近20年来分子生物学技术的快速发展，使用分子生物学方法研究细菌性阴道病复发的机理和细化诊断临床不同细菌性阴道病亚型成为一种趋势，人们对细菌性阴道病的菌群结构研究也在不断深入。长度多态片段PCR(length heterogeneity PCR，LH-PCR)是运用荧光标记的探针来决定来源于不同微生物扩增序列的相对数量，带标记的片段通过毛细管电泳被分离出来，而后被一个带有荧光性的自动基因序列分析仪所监测到。LH-PCR是一种分析微生物结构的方法，其原理是由于基因或基因操纵子的插入或剪切造成某些特定基因固有长度呈现多态性。因此，可以利用这种多态性来确定微生物的种群信息。LH-PCR测定的超变量区域主要存在于核糖体的小亚基(rrn)。

LH-PCR作为一种基于PCR的分子指纹图谱技术，其与高通量测序技术相比具有技术操作灵敏，快速简单，成分低廉等的优点。但是，目前尚未有将该技术应用于医学领域，尤其是将其作为一种疾病的诊断技术的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用LH-PCR技术，制备细菌性阴道病的细菌基因指纹图谱的方法，以及应用该细菌基因指纹图谱精确判断样品中是否存在细菌性阴道病致病菌群的用途。本发明所述的细菌基因指纹图谱能用于细菌性阴道病的临床快速诊断，避免传统的细菌分离培养的诊断不准确、操作繁琐、耗时长、工作量大以及高通量测序价格昂贵等缺点，能够准确、快速有效地检测阴道内的菌群分布状况。

为达到上述目的，本发明提供一种细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，其中所述细菌为阴道内细菌，所述基因为16S rRNA基因。

进一步的，所述细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，是对扩增片段长度为310-380bp的基因片断进行分析。

更进一步的，所述细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，其中当片段长度340-374bp中的任何一个片断的相对峰面积大于10％时，确定为有细菌性阴道病致病菌群存在；当片段长度340-374bp中所有片段的相对峰面积都小于10％，确定为正常菌群，没有细菌性阴道病致病菌群存在。

优选的，所述细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，其中LH-PCR的引物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM荧光标记。