[发明专利]一种细菌性阴道病的LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法及应用

权利要求书

1.一种LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，其中所述细菌为阴道内细菌，所述基因为16S rRNA基因；

所述制备方法是对扩增片段长度310-380bp的基因片断的LH- PCR特征峰进行KruskalWallis Test检验；

当片段长度340-374bp中的任何一个片断的相对峰面积大于10％时，确定为有细菌性阴道病致病菌群存在；当片段长度340-374bp中所有片段的相对峰面积都小于10％，确定为没有细菌性阴道病致病菌群存在；

所述LH-PCR的引物为：5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' 的5'端用FAM荧光标记；

所述细菌的种类选自 Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、 Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、 Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus。

2.根据权利要求1所述的制备方法，包括以下步骤：

1)提取阴道分泌物的细菌基因组DNA；

2)对细菌基因组DNA中的16S rRNA基因进行PCR扩增：

3)引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM荧光标记；

4)PCR的反应体系：10×缓冲液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL， BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH2O补足50μL；同时设置不添加模板的阴性对照；

5)反应程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后于4℃恒温保存；

6)毛细管电泳LH-PCR产物：

7)将所述PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行富集，收集300-400bp的片断；然后用Qiagen凝胶回收纯化，并与Hi-Di甲酰胺及GS500Liz内部尺寸标准混合，混合物在PCR仪中在95℃下变性5min，再进行毛细管电泳检测，注射时间为10s，注射和运行电压为15.0kV，运行温度为60℃，运行时间为70min；

8)收集样品的指纹电泳图谱，对扩增片段长度为310-380bp的片断进行KruskalWallis Test检验。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述细菌种类和对应的扩增片段长度为：

。

4.一种利用权利1-3所述的制备方法制得的LH-PCR细菌基因指纹图谱，其中所述细菌为阴道内细菌，所述基因为16S rRNA 基因，所述图谱为对扩增片段长度310-380bp的基因片断的LH-PCR特征峰进行Kruskal Wallis Test检验。