[发明专利]三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法

摘要

本发明公开一种三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法。本发明针对番茄溃疡病菌、番茄细菌性叶斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌，提供了检测番茄溃疡病菌的专用引物，目标产物片段为1086bp；检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物、目标产物片段为491bp；检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At、目标产物片段为290bp。本发明还提供了针对该三种病原菌的多重PCR最佳反应体系和反应条件。本发明不需克隆、测序和序列比对，即可快速同时检测番茄溃疡病菌，瓜类细菌性果斑病菌，番茄细菌性叶斑病菌，特异性强、快速、准确，节约了检测成本和时间，解决了单重反应的局限性。

主权项

三种细菌性病菌的多重PCR检测最优反应体系，其特征在于：该最优反应体系由以下反应物质和反应条件组成：(1)反应物质的总体积为50μl，并由以下物质及用量组成：10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物1.5μl；10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物1.5μl；10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物0.5μl；10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物0.5μl；10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物1.5μl；10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物1.5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；5U/μL Taq polymerase 0.4μl；2.5mmol/L dNTPs 2.0μl；50mmol/L Mg2+0.5μl；1×105cfu/mL‑1×108cfu/mL待检菌液样品1μl；余量：RNase Free dH2O；(2)反应条件：95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec,72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；所述三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌；所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp；所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp。