[发明专利]一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的试剂盒及检测方法。本发明首先提供了一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的引物和探针，所述引物和探针为两组：一组用于检测总霍乱弧菌：其引物核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；另一组用于检测致病性霍乱弧菌：其引物核苷酸序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。本发明还提供了利用微滴式数字聚合酶链式反应绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的方法，该方法特异性强、灵敏度高、扩增效果好，可操作性强，易于标准化。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的引物/探针和试剂盒，更具体地，涉及一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)试剂盒和检测方法。

背景技术

霍乱弧菌(V.cholera)是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻和失水，死亡率甚高。霍乱弧菌主要存在于近海水域，通常可经污染的水源或食物尤其是水产品而感染人。O1和O139是霍乱弧菌两个最主要的致病血清型，同霍乱的大规模暴发流行密切相关，其主要的毒力因子包括ctxAB基因编码的霍乱毒素(CT)和tcpA基因编码的毒力协同调节菌毛(TCP)。霍乱弧菌的其他血清型统称为非O1/非O139，主要引起散发的霍乱样疾病，多分离自轻度腹泻病人和环境样本中。近年来研究显示，由于血清型间存在基因的水平转移，部分O1和O139群霍乱弧菌并不会产生CT和TCP，也不存在相应编码基因，而部分非O1/非O139群霍乱弧菌也可能获得上述致病基因，而成为潜在的新暴发流行株。因此，加强对食品等环境样品中霍乱弧菌及其致病基因的检测鉴定，对于防止疾病的爆发流行，确保食品安全具有重要的现实意义。

目前针对霍乱弧菌的标准检测方法仍以传统增菌培养法为主，需要经过增菌培养、选择性平板分离、生化鉴定、血清学试验等复杂的过程，不仅耗时费力，而且样品中潜在的其他杂菌有可能会因过度增殖而给目标菌鉴定造成干扰。另外，食品中的霍乱弧菌经常以“活的不可培养状态(VBNC)”存在，培养法无法有效检测到这部分细菌，从而影响检测结果的准确性。近年来，以实时荧光PCR(qPCR)为代表的分子生物学方法也逐渐被广泛应用到霍乱弧菌的检测中去，较传统方法更加简便、快速、灵敏、特异，并可实现对靶基因的定量检测。但qPCR属于相对定量，结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率，并且需要具备已知浓度的核酸标准品。目前尚没有一个官方权威机构可以提供这种具有明确量值(即核酸拷贝数或质量浓度)的霍乱弧菌核酸标准品。在实际检测中对自行构建的核酸标准分子的定量分析多采用紫外分光光度法，得到的是260nm处所有核酸分子的吸光度值，标准品中其他DNA或RNA分子以及蛋白等杂质成分均会影响测定结果的准确性。正是由于qPCR定量检测中缺乏统一的核酸标准品，加上样品中存在不同程度的核酸扩增抑制成分干扰导致标准品和待测样品扩增效率的差异，因此，不同实验室间qPCR的定量检测结果往往缺少可比性。

新兴的微滴式数字PCR(ddPCR)被认为是第三代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中DNA分子的数量为1或0，然后通过PCR扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数，从而实现对DNA分子的绝对定量。目前该技术用于微生物的定量分析尚处于起步阶段，相关的研究如临床样本中人疱疹病毒、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、寄生虫隐孢子虫，牛粪便样本中产志贺毒素的大肠埃希氏菌，以及导致梨火疫病和马铃薯褐腐菌病的植物病原菌等，尚未见到可用于食品中霍乱弧菌定量检测的相关报道。由于食品基质多富含蛋白、脂肪、果胶等核酸扩增抑制成分，背景菌构成复杂且浓度较高，因此，ddPCR对食品中霍乱弧菌定量分析的有效性和实用性尚未可知，开发空间和应用前景广阔。

发明内容