[发明专利]通过慢病毒介导RNA干扰抑制SOCS3表达在防治糖尿病胰岛素抵抗的应用

说明书

技术领域

本发明属于糖尿病防治领域，具体涉及一种可抑制SOCS3表达的shRNA干扰慢病毒在在防治糖尿病胰岛素抵抗的应用。

背景技术

糖尿病是目前危害人类生命健康的重大疾病之一，随着生活方式的改变和肥胖人数的增加，全球糖尿病的患病率呈逐年上升趋势，其中2型糖尿病（T2D）占糖尿病患者的90%左右。T2D是一种多因素所致的疾病，目前对它的病因及发病机制尚未完全阐明，国内外现主要以生活方式干预及药物干预治疗T2D，尽管近年来研制出多种治疗T2D的新药，但未能从根本上彻底治疗糖尿病，以阻止其他并发症的发生。因此，如何让糖尿病达到完全治愈，受到了世界医学界的广泛关注，对它的研究也随之加深。大量研究提示胰岛素抵抗是T2D发病机制的核心，贯穿于糖尿病发生、发展全过程。胰岛素抵抗即一定量的胰岛素与其特异性的受体结合后其生物学效应低于正常，主要体现在胰岛素靶器官对胰岛素的敏感性降低，表现为血糖升高，体内胰岛素代偿性增加。从胰岛素与受体结合到作用于最后靶分子的过程中,任何一个环节受阻或减弱皆有可能引起胰岛素抵抗，而胰岛素信号传导通路障碍是胰岛素抵抗的主要原因。

基因治疗是随着分子生物学，分子免疫学及细胞生物学的发展逐渐发展起来的一种治疗疾病的新方法，它能够从基因水平的改变治疗糖尿病，具有不良反应小、血糖平稳和预后好等优点，越来越受到学者的重视。RNAi技术是在转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具。慢病毒是RNAi理想的载体，慢病毒载体对细胞有较高的亲和力，感染效率高，能够使目的基因整合到宿主细胞基因组，达到长期稳定的表达，已被广泛应用于许多疾病的治疗研究中。本研究组成员前期研究发现，通过RNAi下调下丘脑SOCS3基因能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖、改善瘦素抵抗和相关的代谢紊乱。近些年，随着研究的深入，人们发现SOCS3信号通路对胰岛素信号传导通路具有重要调节作用，积极参与胰岛素抵抗的形成过程，在T2D的发病机制中起重要作用。我们前期研究发现T2D大鼠通过上调SOCS3基因，降低IRS1表达和增加IRS1丝氨酸磷酸化，诱发胰岛素抵抗。国外研究显示通过基因敲除技术使肝脏和骨骼肌SOCS3表达缺陷，可提高胰岛素敏感度，改善胰岛素抵抗。

我们在前期研究的基础上结合分子科学领域最新热点，首次提出抑制SOCS3表达，可能减少对胰岛素信号传导通路的抑制，进而提高胰岛素的生物学效应，阻止胰岛素抵抗的研究思路。探讨下调SOCS3基因对胰岛素信号传导通路的作用及机制，为进一步寻求糖尿病的基因治疗提供实验依据。靶向针对SOCS3基因的shRNA序列对于开发新的抗糖尿病基因药物和提高糖尿病的治疗效果有重要意义，具有广阔的应用背景和经济价值。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种能高效抑制SOCS3表达的shRNA。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制SOCS3表达的shRNA，合成序列如下所示：

正义链：

5'-CACCGAGAGCTTACTACATCTATTCTTCAAGAGAGAATAGATGTAGTAAGCTCTCTTTTTTG-3'

反义链：

5'-TCGACAAAAAAGAGAGCTTACTACATCTATTCTCTCTTCAAGAATACATGTGATAAGCTCTCGGTG-3'

所述的shRNA应用于抑制SOCS3（Gene ID:89829）基因的表达。靶向序列为GAGAGCTTACTACATCTATTC。

本发明的另一目的在于提供一种可防治糖尿病胰岛素抵抗的药物。

该药物含有如上所述的shRNA作为药物的活性成分。该药是通过慢病毒载体感染宿主细胞将shRNA药物整合至目的基因组，从而抑制SOCS3基因表达和防治糖尿病胰岛素抵抗。

制备上述高效抑制或治疗糖尿病胰岛素抵抗的药物步骤如下：

针对大鼠SOCS3基因序列设计出4条SOCS3基因表达的小干扰RNA（siRNA）序列，并合成短发夹RNA（shRNA）双链DNA，克隆到慢病毒载体质粒中，产生大鼠SOCS3shRNA表达质粒。在C6大鼠神经胶质瘤细胞进行筛选后将干扰效果最高的质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，收集含慢病毒颗粒的293T细胞上清液，浓缩后得到高滴度的SOCS3RNAi慢病毒。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的抑制SOCS3表达的shRNA是通过转染C6大鼠神经胶质瘤细胞，经检测干扰效果筛选得到的；可使SOCS3mRNA和蛋白水平表达下调70%。