[发明专利]一种基于肽核酸探针的酪蛋白激酶-1基因突变检测试剂及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及临床分子诊断技术领域，特别是涉及一种基于肽核酸探 针的酪蛋白激酶-1(CK1)基因突变检测试剂、PCR检测方法及应用。

背景技术

Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高 度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程 中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信 号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt 信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的 Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的 β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白 升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因 子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。

CK1蛋白是Wnt信号通路中β-catenin上游重要成员之一。其主要作用是能够与 Axin2、GSK3β、APC等蛋白结合形成复合体，促进细胞质中β-catenin的降解。目前越来越多 的研究已经发现，在很多肿瘤中CK1蛋白均呈现不同程度的突变。

目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达 水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及CK1蛋 白作为Wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的 重要问题，尤其是在CK1基因激酶结构域中发生的突变，对CK1蛋白发挥功能起着非常重要 的作用，例如在睾丸生殖细胞癌细胞中检测出G72DS突变，肝癌细胞中检测出F101L突变等。

肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA 类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的 第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代 了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的 形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的 杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远 优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。

本方法采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类 似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥 所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势， 大大提高了检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中核心的信号分子CK1基 因突变情况，以及如何解释核心分子CK1在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种 检测Wnt信号通路中CK1基因突变检测试剂、PCR检测方法及应用。

本发明的目的是提供一种用于酪蛋白激酶-1(CK1)基因突变检测的试剂，包括用 于阻断野生型CK1基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增G72D、F101L突变型CK1基因 序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：

所述检测CK1基因G72D突变正向引物如序列表中SEQIDNO.1；

所述检测CK1基因G72D突变反向引物如序列表中SEQIDNO.2；

所述检测CK1基因F101L突变正向引物如序列表中SEQIDNO.3；

所述检测CK1基因F101L突变反向引物如序列表中SEQIDNO.4；

所述检测CK1基因G72D突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.5；

所述检测CK1基因F101L突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.6；