[发明专利]一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法

权利要求书

1.一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)探针设计合成

根据基因组目标区域，以已知基因组序列为参考，以瓦片阵列的方式设计生成探针群，探针长度为100～120bp，并过滤掉高度重复探针，在探针两端加入通用引物，并合成作为探针模板，以此模板体外转录制备参入生物素标记核苷酸的探针；

(二)文库构建

按照插入片段大小为200～300bp构建DNA文库，文库浓度不低于15ng/μl；

(三)杂交捕获

1)分别配置文库混合液、杂交混合液和捕获混合液；

2)PCR仪设定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；

3)放入文库混合液，开始程序第一步：95℃5min；

4)到程序第二步65℃3min时，立即将杂交混合液放入；

5)到程序第三步65℃2min时，立即将捕获混合液放入；

6)到程序第四步后，在PCR仪上，将文库混合液、杂交混合液与捕获混合液混合；

7)65℃杂交36个小时；

8)用磁珠捕获步骤7)的杂交产物；

其中，文库混合液含Human cot-1、通用寡核苷酸、步骤(二)构建的文库和文库对应的blocker序列

其中，杂交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成；其中，捕获混合液为含步骤(一)所述探针和RNase抑制剂的溶液；其中，杂交混合液的的具体配置为：4*SSPE 20μl、pH 8.0、0.1M EDTA0.8μl、50×Denharts 8μl、0.1％SDS 8μl。

2.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，其中步骤(二)构建文库进行的PCR循环数不超过9次。

3.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述文库混合液的配置方法如下：在1.5mLEP管中加入：Human cot-1 5μl、500μM Universal oligo 2μl、1-8种DNA文库每个文库200ng，各DNA文库对应的blocker 200μM各1μl，盖上后，用注射器针头在盖上扎3-5个孔，65℃离心真空干燥至看不见明显液滴，12000rpm离心2min，打开盖，底部加入8μl水，盖上盖，用封口膜将盖子上的孔封住，涡旋，12000，2min，并转移到PCR管。

4.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述捕获混合液的配置方法如下：步骤(一)所述探针5μl、RNase抑制剂1μl。

5.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述步骤(三)第6)步为到程序第四步后，在PCR以上，移7μl文库混合液与13μl杂交混合液至捕获混合液，上下吹吸10次。

6.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述的blocker选自SEQ IDNO.1-96所示的序列。

7.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，其中步骤(二)构建文库时包括采用Ampure磁珠对打断产物纯化的步骤。