[发明专利]一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法。本发明突破了普通PCR方法的限制，可实时定量样品中细菌含量，灵敏度高，最低检测极限达到每个反应5个拷贝数；特异性强，可特异性识别猪链球菌和猪链球菌2型，对其他细菌无反应；重复性好，重复检测的变异系数小于1.19%；而且临床诊断效果明显，非常适合大量临床样品的检测和猪链球菌的常规疫情监测，具有极高的应用价值。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法。

背景技术

猪链球菌是造成生猪养殖业重大经济损失的主要病原之一，全球几乎100%规模化猪场均有猪链球菌存在，可通过呼吸道相互传播，主要引起败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等症状。同时猪链球菌也是一种人兽共患病病原，人可通过接触带菌猪或猪肉产品感染，引起败血症、脑膜炎，甚至休克样综合症导致死亡。尽管50年来人感染猪链球菌大多为职业性接触性的散发病例，比如养殖户、兽医、屠夫、食品加工者等；但最近几年的人感染猪链球菌病例的数量不断增加，并趋向于常规人群，在中国就有过两次猪链球菌2型的区域大流行，严重威胁公共卫生安全，所以对猪链球菌的监测至关重要。

猪链球菌为革兰氏阳性球菌，是猪身上的正常寄生菌，主要定植在猪的上呼吸道中，尤其是在扁桃体和鼻腔，也可定植于生殖器和消化道内。根据荚膜多糖的抗原性，将猪链球菌分为35个血清型（1～34型及1/2型），多数参考菌株是从病猪上分离得到的，而14型是来源于人，17、18、19和21型来源于健康猪，20和30型来源于病牛，33型来源病羔羊。猪链球菌致病性的划分现在还比较模糊，不过现有研究表明1、2、1/2、7、9、14型是猪群中的主要致病血清型，2、14型为人群中的主要致病血清型。调查显示不管是对人还是猪，2型都是最为主要的致病菌，其致病力是最高的，并且是北美、南美、欧洲、亚洲、澳大利亚等地区流行率最高的血清型，占全球人和猪病例数的74.7%和27.9%，所以猪链球菌2型是疫情监控和病原鉴定的首要检测对象。

目前细菌分离培养与血清学分型结合仍然是诊断猪链球菌的金标准，但此方法无法检测出无荚膜菌株和自凝菌株，并且耗时，灵敏度低，操作要求高，不利于推广和疫情监测。为弥补这些的不足，研究者建立了多种猪链球菌的基因分型方法，在基因水平上实现对猪链球菌的鉴定与分型，并提高了检测的准确性和灵敏度。包括针对型特异性的cps基因序列设计分型PCR，这部分研究大多集中在主要致病菌上，但最近刘志杰和Anusak Kerdsin针对33个血清型CPS基因设计了多个多重PCR，建立全套的基因分型方法，实现了对33个血清型的特异性检测；当然现使用最多基因分型方法的还是Samantha J. King建立的针对猪链球菌多个保守基因的MLTS方法，此方法主要检测cpn60，dpr，recA，aroA，thrA，gki，mutS等7个保守基因，根据这7个基因的基因型进行编码确定猪链球菌的血清型（ST），这一方法广泛用于猪链球菌的分子流行病学调查，并建立有MLTS数据库，可方便了解猪链球菌的全球流行和分布情况。不过这两个基因分型方法都比较费时费钱，而且交叉污染的风险大，只能针对少量样品，不适合疫情监测和初步筛查过程中的大量样品的检测。

与常规PCR相比，TaqMan荧光定量PCR具有以下优点：第一，为封闭反应，无需对PCR产物进行后续处理，进一步缩短检测时间并降低了交叉污染的风险；第二，增加荧光探针后，检测的灵敏度和特异性进一步提高；第三，整个扩增过程可实时检测，结果直观，有利于大量样品同时检测；第四，定量采用对数期扩增数据，非终点定量，结果更为可靠。目前研究者建立了多个猪链球菌荧光PCR方法，包括高志强针对猪链球菌16S RNA设计的通用型荧光PCR方法，高志强及孙洋针对cps2J基因设计的猪链球菌2型的荧光PCR方法，不过这些方法都为单荧光PCR，无法实现单管内同时检测猪链球菌和猪链球菌2型，增加了疫情监测的工作量和成本。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和探针。