[发明专利]一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和探针，引物的核苷酸序列如下所示：

引物GDH-F：5’-GAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC-3’(SEQ ID NO：1)，

引物GDH-R：5’-CCATGGAACACGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO：2)，

引物CPS2J-F：5’-GATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT-3’(SEQ ID NO：4)，

引物CPS2J-R：5’-CCATTTGGTAACCGGAAAAGTT-3’(SEQ ID NO：5)；

探针的核苷酸序列如下所示：

探针GDH-P：5’-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-3’(SEQ ID NO：3)，

探针CPS2J-P：5’-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-3’(SEQ ID NO：6)，

或者为探针的核苷酸序列的核苷酸互补序列。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针GDH-P和CPS2J-P2的5’端标记的荧光基团不相同。

3.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针。

4.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从样品中提取病菌DNA；

2)以提取的DNA和阳性标准品DNA为模板，用权利要求1所述的引物对GDH-F、GDHR、CPS2J-F和CPS2J-R，及权利要求1或2所述探针GDH-P和CPS2J-P2进行双重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的猪链球菌和猪链球菌2型中的目标基因进行定性和定量分析；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中的双重荧光定量PCR扩增反应体系为：

2×Premix Ex Taq buffer12.5μl

10μM引物GDH-F0.5μl

10μM引物GDH-R0.5μl

5μM探针GDH-P1μl

10μM引物CPS2J-F0.5μl

10μM引物CPS2J-R0.5μl

5μM探针CPS2J-P1μl

模板DNA1μl

50×ROX Reference Dye0.25μl

无RNA酶水补至25μl。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中双重荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述结果分析的具体过程为：

1)定性分析：出现探针GDH-P5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌通用型阳性，扩增出现探针CPS2J-P5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌2型阳性；未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪链球菌通用型和2型，为阴性；

2)定量分析：根据阳性标准品的标准曲线，将待测样品猪链球菌通用型或2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌通用型或2型的基因拷贝数。