[发明专利]一种昆虫杆状病毒纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫杆状病毒的纯化方法。

背景技术

近年来，随着人们环境保护意识的增强，对环境影响小并且能高效杀死害虫的生 物农药越来越受到人们的青睐。特别是2008年以来，在北京奥运中深入人心的绿色概念被 人们普遍接受和认可，加上政府对绿色农业和林业的大力度支持，使得研制新型生物农药 成为各高校和研究机构研究的重要课题。而昆虫杆状病毒由于其专一性较高，对水体、土 壤、天敌、人畜等无害，被列入农业部首批公布的《无公害农产品生产推荐使用农药品种名 单》。

昆虫的病毒种类繁多，目前已报道的有1600多种，分属13科21属。杆状病毒属于杆 状病毒科（Rhabdoviridae），其包括核型多角体病毒和质型多角体病毒。杆状病毒与常见的 动植物病毒不同，是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，并且以单个或者多个病毒包裹 在蛋白壳的形式形成病毒粒子，直径从几百纳米至一千多纳米；而常见病毒的粒子一般只 有几十至一百多纳米，甚至可以在光学显微镜下观察。由于杆状病毒的粒子大小与常见病 毒的粒子相差很大，因此在分离纯化中很难将杆状病毒中混有的其他细菌去除。

在昆虫杆状病毒的增殖方法中，常用的方法为接种昆虫幼虫，待昆虫发病死亡后 收集虫尸，进而分离纯化得到杆状病毒。但是，由于虫体死亡过程中会由于虫体抵抗力下 降，而有其他细菌同时侵入，虫体死亡后也会有大量其他细菌侵入。因此利用这种方法所获 得的杆状病毒一般都混有大量的其他细菌，并且其他细菌的种类多样。

常见病毒分离纯化方法均是针对于常见的直径较小的病毒，在单独或者联合使用 超滤、层析、去污剂、超速离心等方法后可以得到纯化的病毒。但是，由于昆虫杆状病毒颗粒 较大，利用分子大小进行分离纯化的方法均不能将其与细菌等微生物很好的分开。另外超 速离心、层析等方法对设备和技术要求较高，成本也相对较高。开发一种操作简单、工艺可 靠、质量高、用时短、费用低的昆虫杆状病毒的纯化方法尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种昆虫杆状病毒的简单高效纯化方法。

本发明提供了一种昆虫杆状病毒的纯化方法，是将昆虫杆状病毒液依次进行收 集、差速离心、裂解、微滤，得到纯化的昆虫杆状病毒液，

包括如下步骤：

(1)收集感染病毒昆虫初始杆状病毒液；

(2)将步骤(1)得到的初始杆状病毒液进行差速离心，收集上清液，得到粗提杆状病毒 液；

(3)将步骤(2)得到的粗提病毒液进行裂解，得到不含蛋白壳的杆状病毒液；

(4)将步骤(3)得到的杆状病毒液进行微滤，得到纯化的昆虫杆状病毒液。

以上步骤(1)中，所述昆虫初始杆状病毒液的收集方法为：将昆虫杆状病毒接种于 饲养的昆虫幼虫，待昆虫幼虫死亡后，加入研钵中研磨，用双层纱布夹单层脱脂棉过滤，得 到昆虫初始杆状病毒液。

以上所述昆虫杆状病毒可为油桐尺蛾核型多角体病毒。

以上所述昆虫幼虫可为油桐尺蛾幼虫；所述幼虫的幼虫龄期为3-5龄；所述病毒接 种的接种剂量为1×10⁷PIB/虫-1×10⁸PIB/虫，所述饲养条件为27-29℃，光周期L:D=16: 8，湿度35-45%。

进一步说明的是，所述幼虫龄期为4龄，接种剂量为1×10⁷PIB/虫，饲养条件为28 ℃，光周期L:D=16:8，湿度40%。

以上步骤(2)中，所述差速离心的方法为：4℃、800-1000rpm、3-5分钟；4℃、10000- 12000rpm、20-30分钟；重复上述步骤3-10次，得到粗提病毒液。

进一步说明的是，所述差速离心的具体方法为：4℃、800rpm、3分钟；4℃、 12000rpm、30分钟；重复上述步骤5次，得到粗提病毒液。

以上步骤(3)中，所述裂解的方法为：将粗提病毒液以1:9-1:12的比例加入0.5% NaHCO₃中，室温静置20-30分钟，得到裂解病毒液。

进一步说明的是，所述裂解的方法具体为：将粗提病毒液以1:10的比例加入0.5% NaHCO₃中，室温静置20分钟，得到裂解病毒液。