[发明专利]一种生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法

说明书

本发明公开了一种生物酶法合成(R)‑2‑羟酸的方法，所述方法以重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以式(Ⅰ)所示外消旋2‑羟酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，以pH6.0～9.0缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～50℃、150rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)‑2‑羟酸；所述重组基因工程菌为含2‑羟酸脱氢酶HADH基因、羰基还原酶KAR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌；本发明一菌双质粒三酶共表达系统，创新的成功实现外消旋的2‑羟酸通过一个工程菌转化为单一构型的(R)‑2‑羟酸，避免多菌体的培养，降低菌体总浓度，简化反应过程，减少了中间产物的提取步骤，而且还明显提高了催化效率，更适合级联催化体系的工业应用。

(一)技术领域

本发明涉及一种(R)-2-羟酸的制备方法，特别涉及一种利用单菌双质粒三酶共表达串联氧化还原级联体系催化外消旋2-羟酸生产(R)-2-羟酸的方法。

(二)背景技术

2-羟基羧酸类化合物(2-hydroxy acids)是一类具有相似结构的化合物，它们的结构特点是其羧基侧C1位有一个羟基。2-羟基羧酸由于其同时具有酮基和羟基两个官能团，性质十分活跃。光学纯2-羟酸类手性模块是重要的精细化工中间体和手性药物前体，2-羟基酸对映体还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，以α-羟基酸为催化剂，可以将脂肪族和芳香族醛不对称转化为相应的手性醇。具有光学活性的2-羟基酸已成为研究的热点，如代表性的苹果酸、扁桃酸、邻氯扁桃酸、对氯扁桃酸、苯基乳酸等都是合成重要医药的关键中间体。2-羟酸其R型和S型的结构式如下：

光学活性的2-羟酸是一种极为重要的药物中间体：如R-(-)-扁桃酸广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素，青霉素，抗肿瘤制剂，抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A、氯吡格雷等。研究表明，单一构型的扁桃酸所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；光学活性的扁桃酸还可以用作手性溶剂，用于多种不对称合成反应；光学活性的扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋胺类和氨基酸类以非对映体异构盐形成进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R-扁桃酸拆分，对醇胺类药物也具有很好的拆分效果，以其为拆分剂的药物盐酸舍曲林在国际上就有30亿美金的市场。以(R)-邻氯扁桃酸为中间体的抗血小板聚集药物氯吡格雷居全球最畅销药品排行榜第二位；(R)-间氯扁桃酸是制备吗啡琳药物的衍生物；(R)-对氯扁桃酸是新型卵菌纲病害杀菌剂双炔酰菌胺的原料物质；(R)-2,4-二氟扁桃酸是控制体重的苯乙醇胺类药物的重要中间体。苯基乳酸是一些重要的化学合成物前体，并广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸是抗高血压首选药-普利类药物合成的重要原料。

据不完全统计，目前国际市场上光学活性的2-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；光学活性的2-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。

手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个対映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性化合物在医药、农业、材料和环保等领域都具有广泛的价值。目前，光学活性2-羟酸的获取主要采用化学拆分法和生物催化法两种。

化学拆分法主要包括非对映体盐结晶拆分法、色谱拆分法、手性萃取拆分法，毛细管电泳拆分法。

①非对映体盐结晶拆分法，面临的共同的问题就是价格昂贵，且有一定的毒性，在一定程度上造成了资源浪费和环境污染，目前我国规模化生产的R-扁桃酸均采用该方法生产。

②色谱拆分法，该法设备费用太高，消耗大，成本太高，处理量小，因此仅限于检测以及实验室制备，无法用于商业生产。